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肺癌是当前全世界发病率及死亡率最高的恶性肿瘤,其中75~80%为非小细胞肺癌(non-small-cell line cancer,NSCLC)。药物在非小细胞肺癌的治疗中扮演着一个极为重要的角色。桃金娘作为一味岭南民间常用中药,具有较好的抗癌活性。桃金娘酮(Rhodomyrtone)是从桃金娘[Rhodomyrtus tomentosa(Ait.)Hassk]叶片中分得的一种间苯三酚类化合物。该化合物的化学结构与药理活性均未见报道。本研究主要探讨rhodomyrtone(桃金娘酮)对人非小细胞肺癌A549细胞的增殖抑制作用及其诱导A549细胞死亡的作用机理,进一步阐明rhodomyrtone的抗肿瘤机制,为其应用于非小细胞肺癌的临床治疗提供实验依据。 本实验将通过MTT法,中性红摄取(Neutral red uptake,NRU)法,台盘兰染色和乳酸脱氢酶(Lactic dehydrogenase,LDH)漏出率测定等方法检测Rhodomyrtone的抗肿瘤活性;通过流式细胞术、荧光定量PCR和Western blot测定rhodomyrtone对A549细胞周期的影响;通过Hoechst33258荧光染色、AnnexinⅤ/PI染色、流式细胞术和Western blot等方法测定rhodomyrtone对细胞凋亡的影响;并探讨细胞周期阻滞和凋亡诱导的相关作用机制。 研究结果如下: 1.MTT法等染色方法显示rhodomyrtone可抑制细胞的活力并呈剂量依赖性; 2.流式细胞术结果显示rhodomyrtone使细胞周期阻滞于G1期,并且呈现浓度和时间依赖性; 3.Hoechst33258荧光染料染色、AnnexinⅤ/PI染色和流式细胞术的结果显示rhodomyrtone可诱导细胞发生凋亡,并呈剂量依赖性; 4.流式细胞术结果显示rhodomyrtone对细胞内ROS有明显变化,并呈浓度依赖性; 5.流式细胞术结果显示rhodomyrtone使细胞MMP下降,并呈浓度依赖性; 6.qPCR分析显示rhodomyrtone上调细胞内p53和p21基因的表达,降低了cyclin D1、cyclin E1、cyclin E2、CDK2、CDK4、CDK6、CDC25A和PCNA的基因的表达;Western blot分析显示rhodomyrtone上调细胞内p-p53蛋白的表达,下调CyclinD1及其CDC25A的表达水平; 7.qPCR分析显示rhodomyrtone上调细胞内源性凋亡通路中相关因子Apaf-1,Caspase-9,Caspase-3和Bax的基因的表达,急剧降低Bcl-2的基因的表达,western blot的结果也进一步证实Caspase-9,Caspase-3的活化。外源性凋亡通路相关蛋白Fas,FasL,Caspase-8及TNFR1的表达也上调。通过改变Apaf-1等相关因子激活内源性凋亡通路,又可通过上调Fas,FasL及TNFR1激活外源性凋亡信号通路。 8.基因芯片结果显示:A549细胞中53个基因发生显著变化,其中33个基因上调,20个基因下调。显著变化的基因主要涉及热休克蛋白压力通路、p53通路和MAPK等通路。qPCR分析显示rhodomyrtone上调了p53通路中的p53、TP5313、IGF、IGFBP3、Fas、DR5、MDM2和Bid的基因的表达,下调了热休克蛋白Hsp27、Hsp70和MAPK信号通路中的ATF2、Fos、C-Myc的基因的表达。western blot的结果也进一步证实JNK,p38和p53的磷酸化水平的提高。 9.伤口愈合实验显示rhodomyrtone可抑制非小细胞肺癌细胞的迁移,Transwell细胞侵袭实验结果显示rhodomyrtone可明显抑制非小细胞肺癌细胞的侵袭能力。qPCR法检测结果显示经rhodomyrtone处理后的肺癌细胞N-Cadherin,MMP-2及MMP-9的基因的表达下调。 因此,得到以下结论: 1.首次揭示了rhodomyrtone可以抑制人非小细胞肺癌细胞A549的活力,此抑制作用是通过诱导凋亡和阻滞细胞周期于G1期来完成的,呈剂量和依赖性; 2.Rhodomyrtone对细胞的细胞周期阻滞作用与上调p21和p53的表达量,下调Cyclin D1等细胞周期因子的表达水平有关; 3.Rhodomyrtone对细胞的凋亡诱导作用是通过激活线粒体途径以及外源性凋亡信号通路来调控的,包括上调促凋亡因子和下调抗凋亡因子的表达,从而使MMP耗散、Cyt c的释放增加,最终激活Caspase-3来实现的; 4.Rhodomyrtone诱导细胞发生凋亡是抑制细胞活性的主要原因,细胞周期阻滞是抑制细胞活性的次要原因; 5.Rhodomyrtone可以激活上游的p38和JNK信号通路,把信号传递到下游的p53通路,并抑制热休克蛋白Hsp27和Hsp70的表达。因此,rhodomyrtone能够通过多个途径的共同作用诱导细胞凋亡。 6.Rhodomyrtone在体外可抑制非小细胞肺癌细胞的迁移和侵袭能力,其抑制非小细胞肺癌转移能力的机制可能与下调N-cadherin、MMP-2及MMP-9基因的表达有关。 我们的实验结果证实了rhodomyrtone对人非小细胞肺癌细胞的抑制作用,并研究了相关作用机制,为rhodomyrtone发展成为可能的非小细胞肺癌的有效治疗药物提供理论基础。