论文部分内容阅读
目的:利用比较蛋白质组学技术分析、验证孕中期(14-20周)唐氏综合征(21三体,Down’s syndrome DS)胎儿母体血清和正常胎儿母体血清的差异表达蛋白,筛选与DS相关特异的母体血清蛋白新标志物,为建立DS早期无创产前筛查新方法奠定理论基础。方法:1.血清蛋白的提取取血清样品离心后,吸取中间层,去除上层油脂。稀释后滤膜过滤,然后用Agilent Multiple Affinity Removal Column处理,去除高丰度蛋白。使用超滤管进行浓缩除盐,最后使用Bio-Rad protein assay reagent进行蛋白定量,低温保存备用。2.二维凝胶电泳(Two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)操作步骤参照Gorg等方法和IPGphor等电聚焦系统使用指南进行,每组样品重复实验3次,上样后进行等电聚焦和SDS-PAGE二维凝胶电泳,银染后用干胶仪(Bio-Rad公司)干胶,得到电泳胶片。3.差异蛋白质图谱的建立染色、干燥后的电泳凝胶用Image scaner扫描仪及Lab scan配套扫描软件进行扫描,获取血清蛋白质电泳图像。然后利用Imagemaster 2D Elite 4.01分析软件对实验组和正常组的双相电泳银染图像依次进行强度检测,背景消减、匹配、1D(维)及2D(维)校正,建立平均凝胶图像,量化获取蛋白斑点的灰度值信息,建立差异蛋白质图谱。4.差异蛋白质点的生物质谱分析选取图像分析得到的差异蛋白质点,从凝胶上切取这些点,依次进行脱色、脱水、还原、酶解和萃取。样品与基质液充分混合,取混合液点样于不锈钢点样板上,自然风干。将点样板置于质谱仪中进行分析,获得肽质量指纹图谱。5.蛋白质数据库查询差异蛋白质点将肽质量指纹数据在NCBI蛋白质序列数据库中进行搜索。查询参数:物种分类选择为人类;酶选择为Trypsin;允许的未酶切位点选择为1;固定修饰为carbamidomethyl (C) ,变量修饰为oxidation (M),量误差为0. 5 Da ;肽片段容差选择为100 ppm;离子选择为MH+和monoiso-tope;选择直接输入Mascot Search即可进行数据库检索。6.免疫印迹(Western blotting,WB)验证采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜,杂交等免疫印记的方法对筛选出来的差异蛋白质进行验证,得到放射自显影X光片;光片用可见光/紫外凝胶扫描分析系统(UVP,美国)扫描,再用分析软件系统(LabworksTM Analysis Software,美国)得出积分光密度表。结果:1.二维凝胶电泳1.1血清蛋白定量采用Bradford法对两组标本进行检测,正常组浓度为26.44μg/μl,异常组浓度为22.98μg/μl。1.2.二维凝胶电泳对4例正常组母体血清和4例唐氏综合征实验组母体血清进行了2-DE,实验重复三次,分别得到正常组和唐氏综合征胎儿母体血清蛋白质电泳胶片,染色胶片上的蛋白质斑点清晰可辨,蛋白斑点数约为612~754之间和648~731之间。图像显示实验组及正常组大部分蛋白斑点均位于分子量15.5~120kD、pI 4.0~8.0的区域,特别是35~85kD、pI 4.5~7.5区域,蛋白质斑点分布密集,表明血清中pH极酸和极碱性蛋白质的含量均较少,电泳结果可靠。1.3.差异蛋白图谱建立用Imagemaster 2D Elite 4.01软件分析实验和对照组的2-DE凝胶图谱,正常组平均检测蛋白点684.3±71.0个,实验组平均检测蛋白点690.0±41.5个。分别将实验组和对照组的三次重复试验结果中斑点位置清晰的图像进行合成处理,得到实验组和对照组的合成凝胶电泳图谱,并利用软件进行组间蛋白质点的两两比较,差异值大于1.5倍视为差异显著。与正常组相比,除已用于DS筛查的标志物外,结果还发现实验组中特异表达或表达显著升高的蛋白点19个,表达降低的蛋白点10个,即唐氏综合症母体血清蛋白较正常胎儿母体血清表达显著差异的蛋白点共29个。2.差异蛋白质点的生物质谱分析2.1肽质量指纹图在29个显著差异蛋白点中选择灰度值差异倍数最大的8个进行质谱检测,分别是827,828,830,1565,1724,1773,2199,并获得其肽质量指纹图。2.2.差异蛋白质点在数据库中的查询结果在NCBI蛋白质数据库中,以匹配分值(mowse score)为基础的概率( P)评价数据库搜寻结果的质量,匹配分值的大小表示鉴定蛋白属于随机匹配的可能性,当匹配分值达到或超过66分时,待测蛋白的氨基酸序列与数据库中某已知蛋白的氨基酸序列覆盖率较高,认为匹配的可能性很大,共发现8个蛋白质与之匹配的可能性具有统计学意义。这些差异蛋白质分别是827号dGTPase,828号Chain A, Factor B Serine Protease Domain,830号Beta2-Glycoprotein I,1358号Complement factor H-related protein 1 precursor,1565号Kininogen 1 isoform 2,1724号Chain B, Crig Bound To C3c,1773号Chain B, Human Complement Component C3c,2199号Chain A, Crystal Structure of Lipid-Free Human Apolipoprotein A-I。3.免疫印迹结果3.1免疫印迹放射自显影结果对差异表达的8个蛋白质中的dGTP酶(dGTPase)和β2-糖蛋白I(Beta2-Glycoprotein I)进行免疫印迹验证实验,经放射自显影得到X光片。从图片可以看出DS孕妇血清标本dGTP酶和β2-糖蛋白I分子量所在蛋白质条带明显强于正常孕妇血清标本条带,且内参照物Beta-actin在各泳道中的强度一致性较好,证明WB实验结果可靠。3.2自显影X光片光密度扫描X光片条带用分析软件系统(LabworksTM Analysis Software,美国)扫描得出对应的积分光密度值,即胶片蛋白带的灰度值,由此算出条带蛋白相对含量。结果显示DS孕妇血清标本条带蛋白相对含量均强于正常孕妇血清标本条带2倍以上,与X光片结果一致,进一步验证了蛋白质组学研究结果的正确性。结论:1.采用2-DE技术建立了DS母体血清和正常胎儿母体血清的差异蛋白图谱,并筛选获得了29个表达显著差异的蛋白质点,其中DS母体血清特异表达或表达显著升高的蛋白点有19个,表达降低的有10个。2.利用生物质谱分析技术建立了差异蛋白质的肽指纹图,通过蛋白质序列数据库查询、鉴定出了8种与DS相关的母体血清蛋白新标志物。3.应用免疫印记方法对dGTP酶(dGTPase)和β2-糖蛋白I(Beta2-Glycoprotein I)进行了验证,结果dGTPase和Beta2-Glycoprotein I在DS胎儿母体血清中的浓度均显著高于正常胎儿母体血清,与生物质谱分析结果吻合,进一步证实了蛋白质组学技术筛选出的蛋白质的可信度,提示dGTPase和Beta2-Glycoprotein I是DS胎儿母体血清中的两种蛋白新标志物,有可能用于唐氏综合征胎儿的早期筛查。