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第一部分 目的:建立一种体内研究RNA-蛋白相互作用的新方法,筛选鉴定lncRNA MEG3相互作用蛋白。方法:利用噬菌体MS2衣壳蛋白可与MS2bs RNA特异性结合的特点,设计特异性引物,构建pcDNA3.0-Flag-2×MS2和pcDNA3.0-12×MS2bs表达载体,以及表达非编码RNA MEG3的表达载体pcDNA3.0-MEG3V1-12×MS2bs;共转染细胞,进行RNA免疫沉淀,所得RNA进行实时定量PCR分析验证;所得蛋白进行蛋白质谱分析和Western blot验证。结果:成功构建了 pcDNA3.0-Flag-2× MS2、 pcDNA3.0-12× MS2bs和pcDNA3.0-MEG3V1-12×MS2bs表达载体。实时定量PCR结果表明,与对照相比,RNA免疫沉淀能明显富集MEG3V1非编码RNA分子;蛋白质谱和Western blot结果表明,与对照相比,RNA免疫沉淀能明显富集MEG3V1相互作用蛋白。结论:成功构建了一种体内研究RNA-蛋白质相互作用的表达载体,建立了一种体内研究RNA-蛋白质相互作用的新方法,为RNA-蛋白相互作用研究提供了新的技术手段,成功筛选出了MEG3V1的两个相互作用蛋白,ILF3和PABPC3。 第二部分 目的:构建系列细胞周期蛋白依赖激酶3(CDK3)在哺乳动物细胞的表达载体,并在真核细胞中进行初步的表达。方法:从食管癌细胞中提取总RNA,逆转录PCR扩增CDK3编码区,然后将PCR产物克隆到T载体;扩增后的CDK3片段分别克隆入pcDNA3、pcDNA4、pNTAP和pEGFP等四种哺乳动物表达载体;最后,将获得的表达载体转染小鼠成纤维细胞NIH3T3进行初步的CDK3表达分析。结果:PCR扩增获得约900bp的目的片段,经T载体克隆和DNA序列分析显示重组片段是人CDK3基因序列,全长915bp;CDK3片段分别克隆入pcDNA3、pcDNA4、pNTAP和pEGFP载体,获得相应表达载体;构建的表达载体可以在真核细胞中表达出CDK3蛋白。结论:成功构建了CDK3的系列哺乳动物细胞表达载体,并在NIH3T3细胞中得到表达。