犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)是犬瘟热(canine distemper,CD)的病原体。CD是威胁犬类健康的最严重传染病之一,发病后死亡率极高,且无特异性治疗药物。为此,本试验针对CDV的N基因,建立了快速诊断RT-PCR方法;同时通过RT-PCR方法扩增CDV部分H基因,通过原核表达、复性,成功表达出CDV H蛋白,并构建了H蛋白间接ELISA方法,证实表达的H蛋白具有免疫原性,具体内容如下:1.根据GenBank公布的CDV N蛋白基因序列,设计了一对特异性引物,成功扩增出464bp的CDV N基因片段。测序结果表明该序列与GenBank已经发表CDV基因序列的同源性为94.8%~98.5%。利用本文建立的CDV检测RT-PCR方法对30例疑似CDV病例检测显示:RT-PCR检测方法的阳性检出率为90%、胶体金试纸阳性检出率为86.7%,说明RT-PCR方法检出率和敏感性更优。2.血凝素蛋白是诱导机体产生中和抗体的主要蛋白之一。本文去除H基因高度疏水区核苷酸设计引物,成功克隆了来自南昌CDV病料中CDV长度为1236nt的H基因片段。将该基因片段插入到载体pET32a中,构建了原核表达质粒pET32a-CDVH,重组蛋白H基因在Rosetta菌中获得了高效表达。表达产物以包涵体的形式存在,经包涵体洗涤、复性、Ni柱纯化、透析浓缩,最终获得浓度为0.561mg/m L重组H蛋白溶液。小鼠免疫试验显示,重组蛋白免疫产生的血清抗体效价在1:102400以上,免疫原性良好。3.以7.5ug/m L的复性H蛋白溶液包被96孔酶标板,成功建立了重组CDV H蛋白间接ELISA。间接ELISA条件为:重组蛋白包被浓度7.5ug/m L、1%明胶封闭、血清稀释倍数为1:80、酶标二抗稀释倍数为1:5000,阴阳性血清判定的临界值(OD492)为0.100。试验证明该间接ELISA方法特异性强,重复性良好。对收集的背景清楚血样的检测结果符合预期。