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髓系来源抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)具有显著的免疫抑制功能,在异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)后的急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease,aGVHD)中也发挥了重要的免疫调节作用。mTOR抑制剂雷帕霉素(rapamycin,RAPA)是一种新型的免疫抑制剂,已被证实可有效防治aGVHD。但RAPA如何调控aGVHD中MDSCs及其不同亚群的数量及功能目前尚未有研究报道。本研究中我们首先建立了稳定的小鼠异基因骨髓移植模型,分析了移植后小鼠aGVHD模型中外周血及脾脏中MDSCs的数量及功能的变化规律及其与aGVHD的关系;接着研究了 RAPA治疗对aGVHD模型中MDSCs及其各亚群的数量及功能的影响;最后对RAPA在体外对MDSCs不同亚群的调控作用及其相关机制进行了深入的探讨。我们的研究对于揭示MDSCs免疫抑制功能调控的新机制,寻找aGVHD有效预防和治疗的新策略具有重要的理论和实际意义。第一章小鼠急性移植物抗宿主病模型中MDSCs数量及功能的变化研究目的:通过建立小鼠异基因骨髓移植模型,检测移植后小鼠aGVHD模型中外周血及脾脏中MDSCs及其亚群的数量及功能的变化规律,分析其与aGVHD的关系,为探讨MDSCs细胞在allo-HSCT中对aGVHD的调节作用提供线索。方法:建立小鼠异基因骨髓移植模型,通过观察生存、体重、脱毛等症状,检测供者细胞嵌合度,各脏器病理HE染色及CD3免疫组化等方法来鉴定造模是否成功;建立不同严重程度的aGVHD模型,利用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测移植后不同时间点(移植后2周、4周)各组模型小鼠外周血及脾脏MDSCs及其各亚群的比例变化;分选移植后不同时间点(移植后2周、4周)各组模型小鼠骨髓MDSCs,与活化的小鼠脾细胞体外共培养3.5天,CFSE法检测小鼠脾细胞增殖率,计算增殖抑制率;分选移植后不同时间点(移植后2周、4周)各组模型小鼠骨髓MDSCs,与活化的小鼠脾脏CD4+T细胞体外共培养5天,FCM检测CD4+CD25+细胞占CD4+T细胞的比例,以评估MDSCs体外诱导Treg生成能力。结果:通过X射线8Gy辐照清髓,单纯回输去T骨髓细胞(T-cell-depleted bonemarrow cells,BM-TCD)建立无aGVHD模型,回输BM-TCD+T建立aGVHD模型,根据回输的T细胞量控制aGVHD的轻重程度。移植后7天流式检测嵌合度提示完全嵌合状态,aGVHD组可在移植后16天左右逐步出现体重下降、弓背、腹泻、脱毛、活动减少等aGVHD症状,移植后21天检测各脏器病理,aGVHD组可见细胞坏死,结构破坏,有大量CD3淋巴细胞浸润。流式检测移植后各组模型中MDSCs及其各亚群比例,移植后2周各组小鼠外周血及脾脏中的MDSCs及各亚群的比例均处于较高水平,而移植后4周时,无aGVHD组的外周血及脾脏MDSCs及其各亚群水平有显著下降,而轻度及中重度aGVHD组的MDSCs比例仍保持在较高水平,其中脾脏MDSCs比例与aGVHD的严重程度呈正相关,中重度组的比例较轻度组更高。淋巴细胞共培养的结果提示发生aGVHD后体内MDSCs的抑制脾细胞增殖的功能减弱。体外诱导Treg生成实验提示发生aGVHD后体内MDSCs的体外诱导Treg细胞生成的功能受损。结论:小鼠异基因骨髓移植后aGVHD可诱导脾脏MDSCs的聚集,且与aGVHD严重程度呈正相关,但aGVHD小鼠模型中MDSCs的淋巴细胞增殖抑制功能及诱导Treg生成功能受损。第二章雷帕霉素对小鼠急性移植物抗宿主病模型中MDSCs的作用及机制研究目的:在第一章建立小鼠异基因骨髓移植及aGVHD模型的基础上,用RAPA治疗小鼠aGVHD,对治疗后aGVHD模型体内MDSCs及其各亚群的数量及功能的影响进行了研究,并进一步阐明其作用机制。方法:建立小鼠异基因骨髓移植及aGVHD模型,予RAPA腹腔注射治疗,观察aGVHD症状、体重变化曲线,送检各脏器CD3免疫组化观察T细胞浸润情况;利用FCM术检测移植后不同时间点(移植后2周、4周)模型小鼠外周血及脾脏MDSCs及其各亚群的比例变化;流式分选移植后不同时间点(移植后2周、4周)各组模型小鼠骨髓G-MDSCs亚群,与活化的小鼠脾细胞体外共培养3.5天,CFSE法检测小鼠脾细胞增殖率,计算增殖抑制率;用qPCR的方法检测移植后4周模型小鼠骨髓G-MDSCs细胞中免疫抑制因子的表达情况;在G-MDSCs与脾细胞共培养体系中分别加入iNOS抑制剂L-NMNA、Arg1抑制剂nor-NOHA、L-NMNA+nor-NOHA,观察脾细胞增殖抑制率的变化。分选移植后不同时间点(移植后2周、4周)模型小鼠骨髓G-MDSCs,与活化的小鼠脾脏CD4+T细胞体外共培养5天,FCM术检测CD4+CD25+细胞占CD4+T细胞的比例,以评估G-MDSCs体外诱导Treg生成能力。结果:RAPA治疗可显著减轻模型小鼠aGVHD症状,明显减少各脏器中CD3淋巴细胞的浸润。流式检测移植后模型MDSCs及其各亚群比例,移植后2周时各组小鼠外周血及脾脏中的MDSCs及各亚群的比例均处于较高水平,移植后4周时,无aGVHD组的外周血及脾脏MDSCs有明显的下降,而RAPA治疗组脾脏MDSCs及G-MDSCs亚群比例较其他组有显著上升。淋巴细胞共培养的结果提示发生aGVHD后体内MDSCs的抑制淋巴细胞增殖的功能减弱,但移植后4周时RAPA治疗组G-MDSCs免疫抑制功能可升高至无aGVHD组水平。qPCR方法检测免疫抑制因子的表达,发现RAPA治疗组G-MDSCs细胞中iNOS及Arg1的表达水平较其他组显著升高,在共培养体系中加入两种因子的抑制剂L-NMN A及nor-NOHA后,淋巴细胞的增殖水平明显提高,即可减弱G-MDSCs的免疫抑制功能。体外诱导Treg生成实验提示发生aGVHD后MDSCs的体外诱导Treg细胞生成的功能受损,但移植后4周时RAPA治疗组G-MDSCs体外诱导Treg细胞生成的功能可恢复。结论:我们首次发现RAPA可通过调控MDSCs来发挥aGVHD的防治作用,RAPA治疗可诱导aGVHD小鼠脾脏MDSCs,特别是G-MDSCs亚群的聚集;RAPA治疗可提高aGVHD体内G-MDSCs的免疫抑制功能,其作用主要通过提高G-MDSCs细胞中iNOS及Arg1的表达实现。此外,RAPA还可提高aGVHD模型G-MDSCs体外诱导Treg生成的能力。第三章雷帕霉素对MDSCs及其各亚群的体外调控及机制研究目的:明确RAPA在体外对MDSCs不同亚群的免疫调控作用及其相关机制。方法:用不同浓度的RAPA体外预处理B6小鼠骨髓CD11b+Gr1+,后与脾细胞体外共培养,CFSE法检测小鼠脾细胞增殖率,计算增殖抑制率;流式检测RAPA预处理前后骨髓CD11b+Gr1+细胞分别对CD4+T和CD8+T的抑制作用;流式分选小鼠骨髓MDSCs不同亚群,RAPA预处理后与脾细胞体外共培养,检测RAPA预处理对不同亚群MDSCs免疫抑制功能的影响;建立小鼠aGVHD模型,予经RAPA预处理的G-MDSCs过继回输治疗,观察模型小鼠的生存改善情况;检测RAPA预处理前后G-MDSCs与小鼠脾脏T细胞共培养体系中T细胞的凋亡情况及CD4+T细胞向Th1/Th2细胞的分化情况;用CBA法检测共培养上清中Th1/Th2细胞因子的浓度;RAPA预处理小鼠骨髓G-MDSCs,与活化的小鼠脾脏CD4+T细胞体外共培养5天,流式细胞术检测CD4+CD25+细胞占CD4+T细胞的比例,探讨RAPA预处理对G-MDSCs体外诱导Treg生成能力的影响。用qPCR法检测RAPA预处理对G-MDSCs细胞中免疫抑制因子的表达情况的影响。分别用比色法、ELISA法、CM-H2DCFDA法检测共培养上清Arg1、PGE2浓度及胞内ROS水平。结果:使用不同浓度的RAPA预处理小鼠骨髓CD11b+Gr1+,发现RAPA100nM预处理浓度可显著增强CD11b+Gr1+的淋巴细胞增殖抑制功能,对CD4+T及CD8+T细胞的抑制功能均有显著的增加。分析RAPA对MDSCs不同亚群免疫抑制功能的影响,我们发现在初始状态下G-MDSCs亚群并不具有免疫抑制性,而M-MDSCs亚群本身就具有非常强的免疫抑制功能,但当两者经过RAPA预处理之后,G-MDSCs细胞被诱导出了明显的免疫抑制性,而M-MDSCs细胞的免疫抑制功能则有所减弱。给予小鼠aGVHD模型回输G-MDSCs及RAPA-pretreated G-MDSCs,发现两者对aGVHD均具有保护作用,而RAPA-pretreated G-MDSCs的免疫保护作用更强。RAPA诱导G-MDSCs免疫抑制功能并非通过诱导T细胞的凋亡,但可显著减少CD4+T细胞向Th1/Th2细胞的分化,并可增强G-MDSCs体外诱导Treg生成的能力。qPCR结果发现经RAPA预处理的G-MDSCs中Arg1及iNOS表达水平较未处理组下降,而COX2、IL-10、TGF-β及NOX2表达无显著差别。收集共培养上清,检测Arg1浓度及胞内ROS水平,两组无显著差异。ELISA法检测共培养上清中PGE2水平,发现RAPA预处理组比对照组组降低。结论:我们首次发现RAPA体外预处理对不同亚群MDSCs的免疫抑制功能有着完全不同的影响,其可显著诱导小鼠骨髓G-MDSCs亚群的免疫抑制功能,但可减弱M-MDSCs亚群的免疫抑制功能。RAPA预处理可减少G-MDSCs诱导T细胞向Th1/Th2分化,并可增强G-MDSCs体外诱导Treg生成的能力。RAPA体外诱导G-MDSCs免疫抑制功能并非通过提高常见免疫抑制因子表达来介导。