【摘 要】
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研究背景和目的诺如病毒（Norovirus,NoV）是引起全球各年龄段人群急性胃肠炎暴发流行及散发的主要病原体,是重要的公共卫生问题。基于NoVVP1氨基酸序列多样性,将其分为10个基因组,共49个基因型。GII.4 NoV是自20世纪90年代以来,全球NoV胃肠炎的主要流行株。然而,在2014～2016年NoV流行季,GII.17新变异株取代GII.4基因簇成为我国该时期的优势毒株。同时,在20
【基金项目】
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国家自然科学基金（No.31771007）
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研究背景和目的诺如病毒（Norovirus,NoV）是引起全球各年龄段人群急性胃肠炎暴发流行及散发的主要病原体,是重要的公共卫生问题。基于NoVVP1氨基酸序列多样性,将其分为10个基因组,共49个基因型。GII.4 NoV是自20世纪90年代以来,全球NoV胃肠炎的主要流行株。然而,在2014～2016年NoV流行季,GII.17新变异株取代GII.4基因簇成为我国该时期的优势毒株。同时,在2015～2018年间,GII.4/2012新变异株在多个国家引起NoV胃肠炎暴发。GII.6 NoV常以散发为主,但近年来该毒株所致胃肠炎的发病率在我国及全球范围内均呈上升趋势。由于NoV的遗传和抗原多样性,缺乏成熟的细胞培养系统,也无合适的小动物感染模型,尚无许可使用的NoV疫苗或抗体药物。因而,本研究结合课题组前期源于一起GII.17 NoV暴发制备的全人源单抗,利用一起GII.6 NoV暴发的感染者恢复期外周血,用噬菌体展示技术制备NoV全人单链抗体,初步鉴定NoV抗原模拟表位,为后续NoV治疗性单抗的研制和中和抗原表位的深入研究奠定基础。研究方法1.人源噬菌体抗体库的构建用密度梯度离心法从外周血中分离得到PBMC,提取总RNA并逆转录为cDNA,PCR扩增抗体重轻链可变区片段,重叠延伸PCR构建scFv,并克隆至噬菌体质粒pCANTAB-5E,构建人源噬菌体单链抗体库,以菌落PCR和DNA测序鉴定抗体库的重组率和多样性。2.人源NoV噬菌体抗体库的淘选以NoVP蛋白为固相抗原,用甘氨酸-盐酸洗脱法对噬菌体抗体库进行4轮生物淘选,获得特异性抗NoV单链抗体,并用Phage-ELISA鉴定其特异性。3.人源NoV单链抗体的制备与生物学特性鉴定以淘选所得阳性噬菌体上清为模板,扩增scFv片段,构建重组表达质粒,并经原核表达系统表达,用GST-resin亲和层析柱进行分离纯化,ELISA鉴定scFv抗体的特异性和中和性。4.NoV抗原模拟表位的初步鉴定用噬菌体展示技术,以人源NoV单链抗体为靶蛋白,对噬菌体随机12肽库进行3轮生物淘选,Phage-ELISA鉴定噬菌体的特异性,ELISA鉴定其与NoVP蛋白的竞争抑制作用,经测序获得抗原模拟表位的氨基酸序列。研究结果1.人源噬菌体抗体库的构建成功构建初级人源噬菌体单链抗体库,库容约8.8×106PFU/mL,该库重组率和多样性均良好。2.人源NoV噬菌体抗体库的淘选噬菌体抗体库经淘选后,有效富集了特异性单链抗体,成功获得10株与NoV P蛋白具有良好亲和力的噬菌体单链抗体。3.人源NoV单链抗体的制备与生物学特性鉴定用原核表达系统成功制备人源NoV单链抗体,10株scFv抗体均能特异性结合GII.4/GII.6/GII.17NoV P蛋白,且这10株抗体对GII.4毒株与HBGA受体的结合均有强阻断作用,有5株对GII.6具有较强的阻断能力,4株对GII.17有一定的阻断作用。4.NoV抗原模拟表位的初步鉴定用噬菌体展示技术初步鉴定NoV抗原模拟表位,得到27条与scFv抗体有高亲和力、与NoV P蛋白具有竞争抑制作用的多肽序列,且发现了 2条共有序列MGLDLWENFQVL和FHWPSYYLTPWV,包含3段高同源性的短肽WXXPXY、YXXXXXXXLXPXXWV 和 MGXDXW,提示它们模拟了 NoV 与scFv抗体结合的抗原表位。研究结论1.利用一起GII.6 NoV暴发感染者恢复期PBMC成功构建人源噬菌体单链抗体库,淘选获得特异性抗NoV噬菌体单链抗体。2.利用原核表达系统成功制备10株与GII.4/GII.6/GII.17 NoV P蛋白均具有良好反应性的全人源NoV单链抗体,且对这3株毒株与HBGA受体的结合均有不同强度的阻断作用。3.利用噬菌体展示技术初步鉴定NoV抗原模拟表位,发现了 2条共有序列,与NoV单链抗体具有高亲和力、且与NoVP蛋白有竞争抑制作用。经比对后,发现了 2段与GII.4/GII.6/GII.17NoVVP1区有高同源性的氨基酸序列:WXXPXY和YXXXXXXXLXPXXWV,可能是不同NoV毒株共同的抗原构象表位;此外,亦发现1段与GII.6VP1区同源性较高的氨基酸序列:MGXDXW,在402-407残基之间,提示其为GII.6 NoV的特异性抗原模拟表位。
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