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第一部分干扰正常人外周血B细胞和系统性红斑狼疮鼠MZ FO B细胞中RasGRP3的表达对下游信号通路的影响目的系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种典型的自身免疫性疾病,其特点是自身免疫耐受缺失产生大量自身抗体导致多器官功能受损。内源性自身反应性B淋巴细胞是SLE发病的重要环节,其发病机制之一B细胞受体(B cell receptor, BCR)通路的高度活化。Ras鸟苷酸释放蛋白3(Rasguanylnucleotide releasing protein3, RasGRP3)作为BCR信号通路下游重要分子主要在B细胞中表达。在前期实验中我们已证明系统性红斑狼疮患者PBMC及B细胞中RasGRP3的mRNA和蛋白质水平均较正常人明显升高,提示RasGRP3在PBMC及B细胞中的异常表达可能参与狼疮发病。本实验用siRNA干扰RasGRP3在正常人外周血B细胞及狼疮鼠MZ FO B细胞中的表达,研究RasGRP3的表达水平对下游信号通路活化的影响,探讨RasGRP3参与系统性红斑狼疮发病的机制。方法收集正常志愿者外周血3例及MRL/1pr.B6狼疮鼠脾脏3例。分别通过Ficoll法及研磨法提取正常人PBMC及MRL/1pr.B6狼疮鼠脾脏细胞,然后采用磁珠分选法纯化B细胞。通过电转染使siRNA干扰B细胞。T通过逆转录PCR方法和Western Blot方法检测RasGRP3在正常人B细胞和狼疮鼠脾脏MZFOB细胞中的mRNA及蛋白的表达。siRNA干扰细胞40h后,使用anti-IgM, CD40L和人重组IL-4刺激人外周血B细胞,anti-IgM, anti-CD40和鼠重组IL-4刺激狼疮鼠MZFOB细胞,在刺激时间为0min和30min时提取细胞。通过western blot方法检测RasGRP3蛋白水平和下游信号分子Erk, Akt以及各蛋白分子磷酸化的水平。结果无论是正常人B细胞还是狼疮鼠MZ FO B细胞,siRNA干扰后细胞中RasGRP3mRNA和蛋白的表达均叫显低于scramble组。刺激30min后,RasGRP3siRNA组Erk, Akt磷酸化水平明显低于Scramble siRNA组。结论通过电转染的方法可以使siRNA成功干扰正常人B细胞及狼疮鼠MZ FO B细胞中RasGRP3mRNA和蛋白质的表达。正常人外周血B细胞及狼疮鼠MZ FOB细胞中RasGRP3表达水平降低可以下调其下游信号分子Erk和Akt磷酸化水平,这也许是RasGRP3参与系统性红斑狼疮发病的机制之一第二部分干扰系统性红斑狼疮鼠MZFOB细胞中RasGRP3的表达对分泌炎性细胞因子及细胞凋亡的影响目的研究沉默RasGRP3后MRL/1pr.B6良疮鼠MZFOB细胞分泌细胞因子及表达凋亡蛋白的情况,进一步探讨RasGRP3参与系统性红斑狼疮的发病机制。方法收集MRL/1pr.B6狼疮鼠脾脏3例。通过研磨法提取狼疮鼠脾脏细胞,然后采用磁珠分选纯化狼疮鼠脾脏MZ FO B细胞。通过电转染siRNA法干扰狼疮鼠脾脏MZFOB细胞RasGRP3的表达。细胞电转染20h后用anti-IgM, anti-CD40和鼠重组IL-4刺激狼疮鼠MZ FO B细胞,在刺激时间为0h和6h时提取细胞。使用realtime PCR方法检测MZ FO B细胞内IL-6及TNFa的mRNA水平。细胞电转染40小时后提取细胞,用western blot法明确凋亡蛋白caspase3及cleaved caspase3活化片段的表达。结果刺激6h后较刺激前MZ FO B细胞内IL-6和TNFa的mRNA表达明显升高,但RasGRP3siRNA组MZFOB细胞内IL-6和TNFa的mRNA明显低于scramble组。siRNA干扰40h后siRNA组MZ FO B细胞caspase3活化片段的表达明显高于scramble组。结论RasGRP3表达降低导致狼疮鼠MZFOB细胞内促炎性因子IL-6和TNFa的mRNA水平降低,同时增加细胞内凋亡蛋白的表达。由此提示RasGRP3可以抑制B细胞分泌炎性细胞因子并促进B细胞凋亡,从而参与狼疮的发生。