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研究背景:视网膜血管异常相关病变是眼科常见的难治性眼病,例如:早产儿视网膜病变（Retinopathy of Prematurity,ROP）、糖尿病视网膜病变（Diabetic Retinopathy,DR）、脉络膜新生血管（Choroidal Neovascularization,CNV）以及视网膜静脉阻塞（Retinal Vein Occlusion,RVO）等。正是由于视网膜的新生血管造成了视网膜的出血、玻璃体腔积血以及视网膜表面增殖膜形成等体征的出现。因此视网膜新生血管的形成和发展与疾病的严重程度密切相关。为了寻找更好的控制视网膜过度血管新生的方法,我们对视网膜新生血管形成机制的研究就显得非常迫切。目前随着人们生活水平的提高,糖尿病的发病率也是与日俱增。糖尿病视网膜病变是糖尿病患者最常见的并发症之一,因此糖尿病视网膜病变的患者也是在逐渐增多[1]。糖尿病视网膜病变过程中如果出现视网膜新生血管,那就标志着患者进入了糖尿病视网膜病变增殖期,随着疾病的加重就可能进一步出现视网膜深层出血、玻璃体积血、牵拉性视网膜脱离等严重并发症,最终会导致视力丧失[2]。前列腺素E2（Prostaglandin E2,PGE2）是花生四烯酸环氧化酶的主要代谢产物,它通过细胞膜表面的前列腺素受体发挥其信号传导作用。研究发现细胞膜上分布有四种前列腺素受体,即EP1R,EP2R,EP3R,EP4R[E-prostanoid1-4receptor（EP1-4Rs）]。有研究表明,PGE2是通过EP4R参与细胞的增殖、血管的生成和迁移[3],但是PGE2促使视网膜新生血管形成与发展的具体机制尚不清楚。不同的视网膜血管性疾病中导致视网膜新生血管形成和发展的机制是一致的,因此本实验主要通过构建氧诱导视网膜新生血管（Oxygen Induces Retinopathy,OIR）的大鼠模型和人视网膜微血管内皮细胞（Human Retinal Microvascular Endothelial Cells,hRMECs）来进行研究和探讨。研究目的:本研究旨在阐明PGE2及其EP4R在促进视网膜新生血管形成过程中所起的作用及机制。研究内容:1、PGE2/EP4R信号传导通路在OIR大鼠模型视网膜病变过程中所起的作用。2、PGE2/EP4R信号传导通路介导视网膜新生血管形成的研究。3、PGE2/EP4R信号传导通路通过非G蛋白偶联的方式活化下游Akt从而促进人视网膜微血管内皮细胞增殖和迁移的作用机制。研究方法:1、通过从高氧环境转移到正常氧环境下孵育新生大鼠的方法来建立OIR模型。2、在新生大鼠的玻璃体腔内分别注射PGE2、Cay10598（EP4R选择性受体激动剂）、AH23848（EP4R选择性受体拮抗剂）或注射对照溶剂,根据实验设计分别进行对比研究和分析。3、对药物处理过的活体大鼠模型进行眼底彩色照相和频域光学相干断层扫描（Spectral-Domain Optical Coherence Tomography,SD-OCT）检查,了解视网膜病变不同程度的形态学改变。4、出生3天的大鼠,取出视网膜组织,对标本进行固定后进行IB4染色,在荧光显微镜下拍照;对出生13天的大鼠模型,通过股静脉注射伊文思蓝（Evens Blue）染色剂,取出大鼠模型的视网膜组织,在荧光显微镜下拍照;分别对视网膜新生血管形成的严重程度进行分析和研究。5、常规细胞培养的方法对hRMECs进行传代和培养。6、Western Blot实验检测PGE2/EP4R信号传导通路上相关靶蛋白的表达。7、WST-1实验检测相关药物刺激后hRMECs细胞的增殖活性。8、通过对细胞周期标志物Ki67免疫荧光实验来检测药物刺激后hRMECs细胞的增殖能力。9、Transwell实验检测相关药物刺激后hRMECs的增殖与迁移能力。10、CO-IP实验检测相关药物刺激后hRMECs内EGFR与Gab1的结合以及EGFR与EP4R的结合。研究结果:1、通过视网膜眼底照相、SD-OCT和H&E染色的研究结果发现:视网膜缺氧可以导致视网膜新生血管形成;在OIR大鼠模型生长到第17天时,视网膜出现渗出、出血、新生血管形成等体征最为明显。在OIR大鼠模型的玻璃体腔内注射PGE2和Cay10598后,视网膜微血管内皮细胞增殖显著;也能够促进氧诱导视网膜新生血管模型的大鼠视网膜新生血管的形成,而予以AH23848预处理则会明显改善OIR大鼠视网膜血管新生。2、PGE2/EP4R信号通路介导了视网膜新生血管的形成。根据实验设计通过对P3（出生第3天）的大鼠的研究中发现PGE2和Cay10598促进了视网膜新生血管化面积和血管密度的增加;而AH23848则对正常的视网膜新生血管发育的面积和血管密度无显著影响。予以PGE2和Cay10598刺激的OIR大鼠在P13（出生第13天）时中央无血管区比正常对照组大鼠明显增加,予以AH23848预处理后的OIR大鼠的视网膜缺血区域比未处理组大鼠减少;同样PGE2和Cay10598刺激的OIR大鼠的视网膜新生血管面积比没有予以药物刺激的OIR大鼠明显增多,而予以AH23848预处理后的OIR大鼠新生血管面积要明显减少。实验表明:由于视网膜相对缺氧导致PGE2/EP4R信号通路激活,从而使视网膜中央血管闭塞并诱导和促进了视网膜新生血管形成。3、PGE2/EP4R信号通路可以促进hRMECs的增殖和迁移。PGE2或Cay10598处理的hRMECs都可以提高磷酸化CREB水平,予以SQ22536[腺苷酸环化酶（Adenylate Cyclase,AC）抑制剂]或H89[蛋白激酶A（Protein Kinase A,PKA）抑制剂]预处理的hRMECs可以显著抑制PGE2诱导的CREB的磷酸化水平。AH23848预处理的hRMECs不能逆转PGE2诱导的CREB磷酸化。通过WST-1、细胞周期标记物Ki67免疫荧光分析和Transwell迁移实验,观察到PGE2和Cay10598处理的hRMECs的增殖和迁移显著增加,AH23848预处理的hRMECs的增殖和迁移显著减少,而SQ22536或H89预处理不能减弱PGE2或Cay10598诱导的hRMECs的增殖和迁移。4、PGE2/EP4R信号通路通过激活Akt通路诱导hRMECs的增殖和迁移。实验发现:PGE2或Cay10598处理hRMECs细胞后可诱导细胞内p-Akt（Thr308）、p-Akt（Ser473）的表达上调;通过WST-1、细胞周期标记物Ki67免疫荧光分析和Transwell迁移试验这三个实验,观察到PGE2和Cay10598处理的hRMECs的增殖和迁移显著增加,AH23848预处理的hRMECs的增殖和迁移显著减少;LY294002（PI3K选择性抑制剂）预处理hRMECs可有效抑制PGE2和Cay10598诱导的细胞增殖和迁移。5、PGE2结合EP4R,通过活化EGFR通路促进hRMECs的增殖和迁移。通过免疫共沉淀实验发现PGE2或Cay10598处理的hRMECs细胞中存在EGFR与EP4R的结合。通过WST-1、细胞周期标记物Ki67免疫荧光分析和Transwell迁移试验这三个实验,观察到使用AG1478（EGFR选择性受体抑制剂）预处理hRMECs可显著抑制PGE2诱导的细胞的增殖和迁移。6、EGFR招募Gab1导致Akt的活化,即p-Akt的上调。通过免疫共沉淀的实验方法发现接头蛋白Gab1与p-EGFR结合、Gab1与EGFR结合形成复合体;AH23848预处理hRMECs通过抑制EGFR/Gab1/Akt信号传导通路,抑制了PGE2和Cay10598诱导的视网膜新生血管的增殖和迁移现象。结论:研究结果表明:PGE2/EP4受体通过激活EGFR/Gab1/Akt信号传导通路来介导hRMECs的增殖和迁移,因此,我们推测该信号传导通路中的信号分子是视网膜新生血管性疾病潜在的治疗靶点。