禽类的卵巢皮层中含有大量的初级卵母细胞，能分离得到大量的形态正常、结构完整的初级卵母细胞至关重要，它是体外培养的第一步。运用酶分离法，人们已经从火鸡的卵巢上分离得到初级卵母细胞，但类似的工作在鸡上还未见报道。本试验通过胰蛋白酶与胶原酶混合处理或单独处理的方式分离性成熟鸡的卵巢皮层中的初级卵母细胞。结果表明：将胰蛋白酶(0.15％)与胶原酶(1.20mg/ml)混合消化性成熟鸡卵巢皮层20min，从鸡的一个卵巢中能获得数量400左右，直径在60～1125μm的初级卵母细胞；其中76.5％的初级卵泡形态正常，带有完整的颗粒细胞层，外包基膜与壳膜。分离卵泡的直径多集中于200～500μm之间；胰蛋白酶(0.15％)消化得到的主要为大卵泡(直径＞250μm)，胶原酶(1.20mg/ml)消化得到的主要是小卵泡(直径＜250μm)。显微镜下观察分离后的初级卵母细胞形态正常，呈球形或椭圆形，胞质均匀，其生发泡完整；电镜分析其超微结构，细胞膜完整，胞质内含有椭圆形或纺锤形的线粒体、高尔基体、粗面内质网以及大量的卵黄颗粒；卵母细胞周围的颗粒细胞呈立方体状紧贴于卵母细胞膜表面，颗粒细胞膜完整，核巨大，胞质内含许多椭圆形线粒体、高尔基体等细胞器。卵母细胞及颗粒细胞内的细胞器结构及其分布正常，没有看到明显的分离操作的伤害。 用TCM199培养液(含10％FBS、2％鸡血清、0.1％PVA、0.22mmol/L丙酮酸钠、2mmol/L谷氨酰胺、青霉素100IU/ml和链霉素100μg/ml)，在96孔培养板中，每孔100μl的培养液条件下，对鸡初级卵泡进行了体外培养。结果表明：初级卵泡在培养板贴壁生长，颗粒细胞与膜细胞从卵泡上伸出，在卵母细胞周围形成细胞层向外扩散，随着培养时间的增加，卵母细胞的形状发生改变，由圆球变得扁平。直径＜200μm的初级卵泡在培养24h后卵泡膜冒泡，胞浆破裂；直径在300-500μm的初级卵泡直径增长、继续存活率高于其他直径(200～300μm，＞500μm)的初级卵泡，直径平均增长100μm，生存至13天。为了研究FSH在卵泡生长发育中的作用，在培养液中添加了一定浓度的FSH，结果显示，当FSH为30ng/ml，作用3天时，作用效果最强，卵泡雌二醇分泌量达到11.35ng/ml；另外，运用原位末端标记法(TUNEL)对生长13天的初级卵泡进行了细胞凋亡检测，结果表明，培养液中加入FSH，一定程度上抑制了颗粒细胞的凋亡。我们将初级卵泡在颗粒细胞饲养层上进行培养，其生存率高于对照组培养的卵泡，体外生存达到19天；不论有无饲养层，每孔3个卵泡共同培养，卵泡雌二醇分泌量、生存率都高于每孔1个、2个、4个培养的初级卵泡，说明3个卵泡共同培养有利于卵泡的生长发育。对培养第5天、第13天的初级卵泡电镜观察表明：培养中的初级卵母细胞中细胞质与细胞膜有很好的发展，线粒体从生发泡移向胞质边缘，呈线粒体环分布，其形状也发生很大变化，由椭圆变为拉长的棒状、哑铃状、L状，嵴发达，基质电子密度深；还有戴帽线粒体出现，这与生长时期的能量代谢有关。高尔基体数量较少，但形状典型；培养13天的初级卵泡中发现卵母细胞膜上有微绒毛出现，这是放射冠的雏形。 生长分化因子-9(GDF-9)是卵母细胞生长发育中重要的调控因子之一，在哺乳动物中已被广泛研究。亦有研究表明，禽类卵巢卵母细胞发育中也存在GDF-9的调节。本试验探讨了GDF-9在体外培养的初级卵泡表达与定位。利用RT-PCR方法，检测到体外培养5天的初级卵母细胞中表达GDF-9基因，用WesternBlot技术进一步检测到了GDF-9蛋白在卵母细胞中强烈表达。通过免疫组化分析，发现GDF-9的表达紧邻颗粒细胞层，分布在卵母细胞质的外缘。由此证明，在体外培养的初级卵泡中也有GDF-9的表达，它对早期卵泡的生长发育起一定的调控作用。 采用OPS玻璃化冷冻法，对鸡初级卵母细胞的冷冻保存进行了初步的研究。将鸡初级卵母细胞培养0h、12h、24h后，冷冻-解冻，体外继续培养86h，结果显示，直接冷冻的卵母细胞继续生存率高于培养12h、24h后冷冻-解冻的卵母细胞(P＜0.05)。通过对冷冻后初级卵泡的电镜观察，培养不同时间的卵母细胞冷冻后表现为不同程度的结构损伤：未经培养直接冷冻-解冻的卵母细胞受损伤的部位主要在基膜层，其层内出现空泡，其它细胞器基本保持正常的结构。培养12h后冷冻-解冻的卵母细胞受损伤最大，主要表现在颗粒细胞排列紊乱，与卵母细胞膜分离，部分线粒体膨胀，电子密度稍降，胞质出现空泡，脂滴形态异常。培养24h后冷冻-解冻的卵母细胞，脂滴形态稍发生改变，其它亚细胞结构未见异常。冷冻使得卵母细胞中的脂滴聚集。所以冷冻保存鸡初级卵母细胞选择新鲜分离的卵泡冷冻效果比较好。