第一部分小鼠椎间盘源性腰痛模型的构建及评价一、研究背景椎间盘源性腰痛是临床最为常见的症状之一,80%以上的成人一生中将会受到下腰痛的影响。目前,下腰痛是人类首要致残原因。尽管脊柱任何结构病变都可能引起下腰痛,但椎间盘退变及其并发的一系列疾病是导致下腰痛发生最常见的原因。椎间盘源性下腰痛是由于椎间盘内部撕裂引起的慢性难治性疼痛,由于其发病机制复杂尚缺乏有效的特异性治疗手段。动物模型对于研究椎间盘源性腰痛发病机制及筛选有效药物至关重要,既往大鼠常被用来研究椎间盘退变与疼痛的关系。目前,转基因小鼠作为模拟人类疾病模型被广泛用于生物学研究领域,且在探讨不同疾病发病机理中扮演了重要角色,然而至今尚无小鼠椎间盘源性腰痛动物模型。因此,建立一种能表现出疼痛行为变化的小鼠椎间盘源性腰痛动物模型具有重大意义。二、研究目的1、构建一种可靠的小鼠椎间盘源性腰痛动物模型;2、探讨小鼠椎间盘源性腰痛发病机制及疼痛传导通路。三、研究方法1、显微镜下暴露小鼠腰椎椎间盘(L4/5、L5/6、L6/S1),利用显微手术刀穿刺椎间盘并去除部分髓核组织,构建椎间盘退变模型。2、术后各时间点Von Frey纤维丝评价小鼠对机械性刺激的反应阈值,热板仪试验评价小鼠对热刺激的反应阈值,丙酮试验评价小鼠对冷刺激的反应阈值,Burrowing行为测试、平底行走及后足站立行为测试评价小鼠自发性行为改变。3、术后第2、4、8、12周通过micro-CT评估小鼠椎间盘高度改变;组织学染色评价髓核和纤维环结构退变及细胞外基质变化。4、术后第2、4、8、12周采用免疫荧光染色评价椎间盘损伤后髓核及纤维环内炎症因子(IL-1β、TNF-α)以及血管、神经因子(VEGF、NGF)的表达变化,PGP9.5染色评估纤维环撕裂后神经纤维长入情况。5、术后第2、4、8、12周免疫荧光双染评价小鼠背根神经节(DRG)中疼痛相关神经肽CGRP、SP、NGF、Trk A的表达,术后第12周采用q RT-PCR对比椎间盘损伤组及假手术组背根神经节中疼痛相关物质在m RNA水平的差异。6、术后第2、4、8、12周通过免疫荧光技术评估小鼠腰段脊髓后角中星形胶质细胞及小胶质细胞激活情况。四、研究结果1、疼痛行为学试验显示:椎间盘损伤组小鼠术后第2周至第12周机械性刺激缩爪阈值均显著低于假手术组;相比假手术组,损伤组小鼠术后第8周和第12周出现热刺激及冷刺激痛觉过敏;Burrowing行为试验显示损伤组小鼠术后第4、8、12周Burrowing能力减弱;自发运动监测仪发现术后第12周损伤组小鼠自发性后足站立次数显著少于假手术组。2、影像学结果显示损伤组椎间盘高度术后呈进行性下降,椎间盘上下终板边缘术后逐渐出现退变性改变,包括骨刺形成、边缘粗糙等,组织学染色结果显示损伤术后椎间盘呈进展性退变,包括脊索细胞减少、蛋白聚糖含量降低、纤维环结构破裂、以及髓核纤维环交界模糊。3、免疫荧光显示:术后早期阶段(第2周和第4周),损伤组小鼠髓核及纤维环内IL-1β和TNF-α阳性细胞数量显著增加,而术后晚期阶段(第8周和第12周)逐渐下降;相反,NGF和VEGF于术后第2周表达显著增高,并维持至术后第12周;自损伤术后第4周,纤维环内神经纤维支配逐渐增加,第12周髓核区域内检测到神经末梢存在。4、术后第2、4、8、12周损伤组小鼠DRG中疼痛相关神经肽(CGRP、SP、NGF、Trk A)的表达显著高于假手术组,且术后第12周,q RT-PCR显示椎间盘损伤显著诱导了DRG中疼痛相关神经肽基因表达水平的上调。5、术后各时间点,损伤组小鼠脊髓后角中星状胶质细胞被显著激活,且数量呈进展性增加;而小胶质细胞数量于术后第2周即升高至峰值,然后逐渐下降。五、研究结论1、小鼠椎间盘损伤术后出现机械性和温度性刺激敏感性增加以及自发性Burrowing数量和后足站立次数减少,提示小鼠处于疼痛状态;另外,椎间盘病理结构于损伤术后呈进行性退变,与临床退变过程相似。这些结果说明采用显微手术刀破坏及去除髓核组织构建小鼠椎间盘源性腰痛模型的方法可靠且稳定性高。2、细胞及分子层面显示椎间盘损伤显著诱导神经血管因子表达增高及神经纤维长入椎间盘内部,以及诱导背根神经节中神经肽和脊髓中胶质细胞数量表达增加,这一疼痛传导机制为深入研究椎间盘源性腰痛发病机理及筛选分子药物靶点提供理论依据。第二部分VEGF/VEGFR1信号在椎间盘源性腰痛发病中的作用及机制一、研究背景椎间盘退变过程伴随新生血管形成及VEGF表达增高,既往研究发现血管内皮细胞生长因子受体1(VEGFR1)参与癌症性疼痛的调节,我们上一部分模型发现椎间盘内VEGF及背根神经节中VEGFR1表达显著增加,提示VEGF/VEGFR1信号可能参与椎间盘源性腰痛的发病过程,但目前尚无相关研究报道。二、研究目的探讨VEGF/VEGFR1信号在小鼠椎间盘源性腰痛中的作用及机制。三、研究方法1、以VEGFR1酪氨酸激酶敲除(VEGFR1-TK-/-)鼠及野生型鼠为研究对象,按第一部分所述方法构建小鼠椎间盘源性腰痛模型。2、采用疼痛测量方法对比两组小鼠术后疼痛行为改变情况,包括机械性和热刺激痛觉过敏及Burrowing行为变化。3、术后12周micro-CT和组织学染色评估两组小鼠椎间盘退变程度,免疫荧光染色评估两组小鼠椎间盘内NGF表达差异、DRG中疼痛相关基因(CGRP、NGF、TRPV1、TRPA1)表达变化、以及脊髓中胶质细胞激活状况。4、体外培养髓核及纤维环细胞,给予VEGF和/或si RNA-VEGFRs干预24小时,采用RT-PCR方法检测Adamts-5、MMP-13、NGF的表达变化。5、体外分别培养VEGFR1-TK-/-鼠和野生型鼠的DRG神经元细胞以及DRG和脊髓器官培养,给予VEGF干预后采用细胞免疫荧光及q RT-PCR法对比分析DRG中疼痛相关基因的表达差异,采用q RT-PCR法检测脊髓中胶质细胞特异性标志基因GFAP和CD11b的表达差异。四、研究结果1、椎间盘损伤术后VEGFR1-TK-/-小鼠机械性及热刺激缩爪阈值显著高于野生型鼠,Burrowing数量较野生型鼠显著增加。2、VEGFR1-TK-/-鼠和野生型鼠术后第12周椎间盘均发生严重退变,但两组之间无显著差异;VEGFR1-TK-/-鼠椎间盘内NGF表达水平较野生型鼠低,DRG中疼痛相关神经肽(CGRP、NGF、TRPV1和TRPA1)表达上调幅度以及脊髓中星形胶质细胞激活程度均显著低于野生型鼠。3、VEGF可显著上调髓核和纤维环细胞中NGF、Adamts-5、和MMP-13的表达,si RNA-VEGFR1可显著阻断VEGF对NGF的上调作用,而si RNA-VEGFR2可显著逆转VEGF对Adamts-5和MMP-13的上调效应。4、VEGF可从蛋白层面及m RNA层面上调野生型鼠DRG中疼痛相关肽(CGRP、NGF、TRPV1和TRPA1)的表达,而对VEGFR1-TK-/-鼠DRG无显著作用。VEGF可显著增加野生型鼠脊髓中神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和CD11b基因的表达,而对VEGFR1-TK-/-鼠脊髓中相关基因无影响。五、研究结论VEGFR1酪氨酸激酶敲除可显著缓解小鼠椎间盘损伤后出现的椎间盘源性腰痛症状,其机制可能与损伤后椎间盘内NGF表达上调幅度、DRG中疼痛神经肽表达增加幅度、以及脊髓后角中胶质细胞激活程度降低有关;体外实验结果提示VEGF可通过VEGFR1介导椎间盘细胞内NGF表达以及介导DRG和脊髓中疼痛信号的传导。这些结果说明VEGF/VEGFR1信号在椎间盘源性腰痛发病中扮演重要角色。