当前,糖尿病尤其是2型糖尿病及其并发症对人类健康构成了日益严重的威胁。α-葡萄糖苷酶能够水解低聚糖释放出葡萄糖,最终导致餐后高血糖,因此,抑制α-葡萄糖苷酶的活性,从源头上延缓葡萄糖的产生,降低餐后高血糖,这是治疗糖尿病的一种主要途径。血糖含量升高对非酶糖基化起到加速作用,会增加晚期糖基化终末产物(Advanced Glycation End Products,AGEs)的产生,而研究表明,AGEs与多种糖尿病并发症的产生有一定的关系。由于目前临床使用的α-葡萄糖苷酶抑制剂和非酶糖基化抑制剂在长期服用下都具有一定的副作用,因此寻找安全、毒副作用小,能同时抑制α-葡萄糖苷酶和非酶糖基化的“多靶点”高效药物显得尤为重要。黄酮类化合物普遍存在于各类天然植物和中草药中,毒副作用小而且具备多种药理活性,从黄酮类化合物等天然植物活性成分中筛选有效的α-葡萄糖苷酶和非酶糖基化抑制剂已成为当今研究的热点。本文主要以α-葡萄糖苷酶和非酶糖基化为作用靶点,采用多种光谱技术联合分子模拟手段,研究了芹菜素、桑色素和高良姜素3种黄酮类化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制动力学和结合机制;运用等效线图解法研究了杨梅素和芹菜、杨梅素和桑色素对α-葡萄糖苷酶的联合抑制行为;以牛血清白蛋白(BSA)-果糖为非酶糖基化体外模型,研究了高良姜素、芹菜素和桑色素分别对非酶糖基化反应初期、中期和末期三个阶段的抑制作用,并探讨了3种黄酮类化合物两两联用对非酶糖基化三个阶段的抑制作用及黄酮化合物之间的相互作用。主要的研究内容和结果如下:1、研究黄酮类化合物桑色素、芹菜素和高良姜素对α-葡萄糖苷酶的抑制作用和抑制动力学。结果表明,桑色素、芹菜素和高良姜素均表现出较强的α-葡萄糖苷酶抑制能力,其IC50值分别为(4.48±0.04)×10-6、(1.05±0.05)×10-5和(2.75±0.05)×10-5 mol L-1,抑制能力桑色素(29)芹菜素?高良姜素抑制能力,均优于阳性对照阿卡波糖[4.02±0.05)×10-4 mol L-1],这可能源于黄酮化合物C环3位羟基化和B环上的多个羟基。桑色素和高良姜素是混合型α-葡萄糖苷酶抑制剂,而芹菜素呈现非竞争型抑制,抑制常数分别为(1.68±0.3)×10-6、(1.07±0.07)×10-5和(4.33±0.4)×10-6 mol L-1。2、运用荧光光谱、圆二色谱和分子模拟方法研究了桑色素、芹菜素和高良姜素与α-葡萄糖苷酶的结合性质。结果表明,3种黄酮类化合物都能与α-葡萄糖苷酶通过疏水相互作用和氢键驱动形成基态复合物,并导致酶的内源荧光猝灭,桑色素、芹菜素和高良姜素与α-葡萄糖苷酶之间都只有一个结合位点,结合距离r值分别为2.52、2.77和4.08 nm,r(27)8 nm而且0.5R0(27)r(27)1.5R0,表明3种黄酮化合物与α-葡萄糖苷酶间发生了非辐射能量转移。同步荧光和圆二色谱结果显示,这些黄酮化合物与α-葡萄糖苷酶的结合改变了酶的构象。芹菜素和高良姜素改变了α-葡萄糖苷酶荧光团酪氨酸和色氨酸微环境极性,且桑色素、芹菜素和高良姜素的加入均使α-葡萄糖苷酶α-螺旋含量减小,分别从30.1%降到25.4%,38.1%降至31.7%,37.1%减少到29.8%。分子对接模拟结果显示,桑色素和芹菜素并没有结合在α-葡萄糖苷酶的活性中心,而是结合在活性中心附近,这种结合诱导了α-葡萄糖苷酶构象发生改变,阻碍了底物进入活性中心的通道,减少了底物进入活性中心发生反应,从而抑制了酶的催化活性。而高良姜素则直接结合在α-葡萄糖苷酶的活性中心,占据了α-葡萄糖苷酶活性位点,使酶的催化活性降低。3、应用等效线图解法研究了杨梅素和芹菜素、杨梅素和桑色素联用对α-葡萄糖苷酶活性的抑制行为及两种黄酮类化合物之间的相互作用。实验结果表明,杨梅素与芹菜素联用时,效价强度比恒定且相加等效线呈线性,在抑制50%的效应水平,杨梅素浓度固定在1.5×10-5 mol L-1和芹菜素浓度固定在9.0×10-6mol L-1时,两者是相加作用;在抑制70%效应水平,当杨梅素浓度固定在高浓度2.25×10-5 mol L-1时,两者联用对α-葡萄糖苷酶的抑制上呈现拮抗作用;而在研究的其他浓度下,杨梅素与芹菜素均有协同抑制作用。杨梅素和桑色素联用时,虽然最大效应相同但Hill系数不同,效价强度比可变,相加等效线是两条非线性曲线,在抑制50%效应水平下,桑色素浓度保持在3.5×10-6 mol L-1以及在抑制70%效应水平下,杨梅素浓度维持在2.25×10-5 mol L-1时,杨梅素与桑色素联用表现为相加作用,而其他研究浓度下则表现为协同抑制作用。此外,杨梅素与芹菜素或者桑色素的联合使用,在低浓度下,其对α-葡萄糖苷酶活性的抑制表现为协同效应,在高浓度下则趋向于相加作用或者拮抗作用。4、通过构建BSA-果糖体外非酶糖基化模型,研究了高良姜素、芹菜素和桑色素单独及两两联用对非酶糖基化过程三个阶段的抑制作用。研究发现,3种黄酮类化合物对非酶糖基化初期代表产物果糖胺和中期产物二羰基化合物都有轻微的抑制作用,对非酶糖基化终末产物AGEs的产生则表现出较强的抑制能力,3种黄酮对三个阶段代表产物形成的抑制都强于阳性对照氨基胍(AG),其中芹菜素的抑制能力最强,高良姜素和桑色素能力相似。高良姜素、芹菜素和桑色素加入到非酶糖基化体系能使荧光性AGEs的荧光发射峰位置发生红移,分别红移了15、8和22 nm,可能是由于体系荧光团附近微环境极性增大引起的。高良姜素与芹菜素、高良姜素与桑色素、芹菜素与桑色素联合使用,展现出强于黄酮单独使用时对非酶糖基化过程三个阶段的代表产物果糖胺、二羰基化合物及荧光性AGEs抑制效果,但联用的抑制行为是相加作用而非协同作用。