第一部分:引言高血糖和/或高血脂诱导的血管内皮胰岛素抵抗（IR）是糖尿病血管并发症（如动脉粥样硬化）发生发展的关键始动环节。过氧化物酶增殖激活受体γ（PPARγ）与叉头框蛋白1（FOXO1）均为调控血糖代谢、脂肪分化及胰岛素敏感性的重要核转录因子。本课题组前期研究表明,高脂高糖（HF/HG）通过ROS-IKK-PIAS1通路介导的PPARγ1-K77 SUMO化可稳定共阻遏蛋白（NCo R）,引起PPARγ1的转录抑制,进而诱导血管内皮IR发生。但PPARγ1-K77 SUMO化是否存在与FOXO1的交互作用,这种作用是否参与调控高脂高糖应激下血管内皮IR的发生发展以及其潜在分子机制如何,目前国内外尚未见报道。在国家自然科学基金的资助下,我们通过构建PPARγ1（1-182 aa）-SUMO-1融合蛋白载体以模拟体内PPARγ1-K77 SUMO化修饰,并分别在细胞和动物水平探究PPARγ1-K77 SUMOylation对血管内皮IR的影响,并进一步探讨PPARγ1-K77 SUMOylation与FOXO1是否产生相互作用,且该相互作用是否正反馈促进HF/HG应激诱导血管内皮IR效应,最后探究PPARγ1-K77去SUMO化是否可逆转HF/HG应激诱导的血管内皮IR,为糖尿病血管并发症的防治提供新的靶点及新途径。第二部分:模拟内源性PPARγ1-K77 SUMOylation过表达载体的构建与表达目的:构建重组腺病毒和腺相关病毒载体,分别感染血管内皮细胞和SD大鼠以模拟PPARγ1-K77位点SUMO化修饰,观察这些载体在细胞和大鼠各组织中的表达和亚定位,为进一步研究PPARγ1-K77 SUMO化修饰在血管内皮细胞IR中的调控作用奠定实验基础。方法:1.构建含PPARγ1（1-182 aa）-SUMO-1融合蛋白（包含AF1及DBD完整功能区且仅包含K77 SUMO化位点的突变株）腺病毒载体[Ad-HisPPARγ1（1-182 aa）-SUMO-1]分别感染脐静脉内皮细胞系（HUVECs）及原代大鼠胸主动脉内皮细胞（RTAECs）以模拟PPARγ1-K77位点SUMO化修饰（Mimic）,以未融合SUMO-1的Ad-His-PPARγ1（1-182 aa）载体作为空载对照（Veh）;2.构建含有血管内皮特异性标记物Tie2启动子的PPARγ1（1-182 aa）-SUMO-1融合蛋白的腺相关病毒[AAV-Tie2-His-PPARγ1（1-182 aa）-SUMO-1]靶向感染大鼠血管内皮细胞以模拟其体内血管内皮细胞PPARγ1-K77位点SUMO化修饰（Mimic）,以未融合SUMO-1的AAV-Tie2-His-PPARγ1（1-182 aa）载体为空载对照（Veh）。利用His-tag抗体通过western blot分别在细胞、动物水平检测载体表达。结果:1.菌落PCR和测序结果均表明,Ad-His-PPARγ1（1-182 aa）及Ad-HisPPARγ1（1-182 aa）-SUMO-1融合蛋白腺病毒载体和AAV-Tie2-His-PPARγ1（1-182aa）及AAV-Tie2-His-PPARγ1（1-182 aa）-SUMO-1融合蛋白腺相关病毒载体均构建成功;2.筛选出细胞感染复数Multiplicity of infection,（MOI）=100为Ad-His-PPARγ1（1-182 aa）及Ad-His-PPARγ1（1-182 aa）-SUMO-1的最佳细胞感染条件,western blot结果表明该腺病毒载体可在HUVECs及RTAECs中成功表达;3.western blot结果表明相比大鼠肝脏、肌肉、脂肪等其他胰岛素敏感靶组织,AAV-Tie2-His-PPARγ1（1-182 aa）及AAV-Tie2-His-PPARγ1（1-182 aa）-SUMO-1腺相关病毒载体在血管组织中有更高的表达,表明其具有较好的血管内皮组织靶向性;4.Ad-His-PPARγ1（1-182 aa）及Ad-His-PPARγ1（1-182 aa）-SUMO-1在细胞核及细胞质内均有表达。结论:模拟PPARγ1-K77 SUMOylaiotn的工具载体Ad-His-PPARγ1（1-182aa）-SUMO-1、Ad-His-PPARγ1（1-182 aa）、AAV-Tie2-His-PPARγ1（1-182 aa）及AAV-Tie2-His-PPARγ1（1-182 aa）-SUMO-1已成功构建并表达。第三部分:PPARγ1-K77 SUMOylation模拟高脂高糖应激诱导血管内皮细胞胰岛素抵抗目的:探索PPARγ1-K77 SUMO化是否产生类似高脂高糖应激诱导血管内皮细胞的IR效应。方法:1.细胞水平证实PPARγ1-K77 SUMO化模拟IR效应:（1）IR模型的建立:分别以HUVECs及RTAECs为研究对象,用含22 m M葡萄糖及0.25 m M棕榈酸的DMEM培养基处理HUVECs及RTAECs 48 h,5 m IU/L胰岛素刺激细胞10 min后,通过检测培养液中NO和ET-1水平以及内皮细胞中PI3K/Akt/e NOS的表达以确认IR模型的建立;（2）腺病毒感染细胞:分别以Ad-His-PPARγ1（1-182aa）及Ad-His-PPARγ1（1-182 aa）-SUMO-1感染正常细胞48 h（MOI=100）;（3）分光光度法检测各实验组细胞上清液中NO和ET-1水平;（4）DHE细胞内活性氧检测探针检测细胞内活性氧ROS的生成水平;（5）western blot分析细胞内p-IKK/IKK、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-e NOS/e NOS的蛋白表达水平。2.整体动物水平证实PPARγ1-K77 SUMO化模拟IR效应:（1）高脂高蔗糖（HFS）饮食诱导大鼠IR模型:采用HFS饲料喂养雄性SD大鼠24周,通过大鼠形态学（身长、体重）及生化指标(FPG、INS、HOMA、OGTT、ITT及血管内皮IR标志物（NO、ET-1、PI3K/Akt/e NOS通路）筛选并确认大鼠整体IR模型;（2）大鼠腺相关病毒注射与感染:正常雄性SD大鼠（6-7周）尾静脉注射AAV-Tie2-His-PPARγ1（1-182 aa）及AAV-Tie2-His-PPARγ1（1-182 aa）-SUMO-1;（3）分光光度法检测大鼠血清中NO和ET-1水平;（4）检测大鼠形态学指标及相关生化指标;（5）活体超声检测大鼠血管对胰岛素反应性;（6）活体超声检测大鼠血管舒张功能;（7）检测大鼠胸主动脉组织中SOD活力、MDA的水平;（8）western blot分析大鼠胸主动脉血管组织中p-IKK/IKK、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-e NOS/e NOS的蛋白表达水平。结果:1.细胞水平证实PPARγ1-K77 SUMO化可模拟HF/HG诱导IR效应。（1）分别在HUVECs及RTAECs细胞水平证明,与HF/HG诱导IR效应类似,PPARγ1-K77 SUMO化后,其NO水平明显下降,而ET-1水平则明显升高;（2）PPARγ1-K77 SUMO化可模拟HF/HG诱导的ROS生成量增加;（3）PPARγ1-K77SUMO化后,p-IKK的表达量上调,并负性调控PI3K/Akt/e NOS信号通路。2.动物水平证实PPARγ1-K77 SUMO化可呈现与HFS饮食诱导相类似的IR效应。大鼠感染AAV-Tie2-His-PPARγ1-K77-SUMO-1后,结果证实:（1）与HFS饮食诱导IR效应类似,大鼠血清NO水平呈显著下降,ET-1水平则明显升高,胰岛素诱导的血管舒张反应性下降;（2）PPARγ1-K77 SUMO化与HFS饮食一样,都可损害内皮依赖性血管舒张功能,对内皮非依赖性血管舒张功能无明显影响;（3）大鼠血液生化指标检测结果表明PPARγ1-K77 SUMO化与HFS饮食一样,可诱导大鼠血清FPG、INS、T-CHO、TG水平的升高;（4）OGTT、ITT实验表明PPARγ1-K77 SUMO化与HFS饮食一样,可造成大鼠葡萄糖、胰岛素耐受性不良;（5）大鼠胸主动脉组织中SOD、MDA检测结果表明,PPARγ1-K77 SUMO化与HFS饮食一样,可破坏机体氧化应激稳态,降低胸主动脉组织中SOD活力,增加MDA的水平;（6）PPARγ1-K77 SUMO化与HFS饮食一样,可诱导血管组织中p-IKK的表达量上调,并负性调控PI3K/Akt/e NOS信号通路。结论:体外和体内研究均证实PPARγ1-K77 SUMO化可产生类似高脂高糖应激诱导的血管内皮IR效应。第四部分:PPARγ1-K77 SUMOylation易化高脂高糖应激诱导血管内皮细胞胰岛素抵抗目的:探索PPARγ1-K77 SUMO化是否易化加重高脂高糖应激诱导血管内皮细胞的IR效应。方法:1.细胞水平证实PPARγ1-K77 SUMO化易化加重IR效应:分别以HUVECs及RTAECs为研究对象,建立高脂/高糖应激诱导IR模型;分别用Ad-His-PPARγ1（1-182 aa）及Ad-His-PPARγ1（1-182 aa）-SUMO-1感染正常细胞48h后继续HF/HG处理48 h,5 m IU/L胰岛素刺激细胞10 min后,检测指标同“第三部分,“方法”1.（3）-（5）”。2.整体动物水平证实PPARγ1-K77 SUMO化易化加重IR效应:按照第三部分“方法”所述建立HFS饮食诱导的大鼠IR模型;正常雄性SD大鼠尾静脉注射AAV-Tie2-His-PPARγ1（1-182 aa）及AAV-Tie2-His-PPARγ1（1-182 aa）-SUMO-1后继续高脂高糖饮食喂养24周;检测指标同“第三部分,“方法”2.（3）-（8）”。结果:1.细胞水平证实PPARγ1-K77 SUMO化联合HF/HG应激可呈现正反馈协同效应,易化加重HF/HG诱导IR效应。（1）分别在HUVECs及RTAECs水平证明,PPARγ1-K77 SUMO化后继续HF/HG处理,其NO水平相比仅HF/HG处理组或是空载对照组均呈现进一步下降,ET-1水平则进一步升高;（2）PPARγ1-K77 SUMO化联合HF/HG应激可协同增加细胞内ROS的生成量;（3）PPARγ1-K77 SUMO化联合HF/HG应激可协同增加IKK的磷酸化水平,并协同负性调控PI3K/Akt/eNOS信号通路。2.动物水平证实PPARγ1-K77 SUMO化联合HFS饮食可呈正反馈易化加重IR效应。PPARγ1-K77 SUMO化后继续HFS饮食喂养,相比仅HFS饮食处理组或是空载体对照组:（1）血清NO水平呈现进一步下降,ET-1水平则加剧升高,超声结果表明胰岛素刺激的血管舒张反应性下降;（2）超声结果表明PPARγ1-K77 SUMO化联合HFS饮食可进一步损害大鼠内皮依赖性血管舒张功能,对内皮非依赖性血管舒张功能影响不明显;（3）大鼠血清生化指标检测结果表明PPARγ1-K77 SUMO化联合HFS饮食可造成血清FPG、INS、T-CHO、TG水平加剧升高;（4）OGTT、ITT实验表明PPARγ1-K77 SUMO化联合HFS饮食可造成大鼠葡萄糖、胰岛素耐受性进一步受损;（5）大鼠胸主动脉组织中SOD活力进一步下降,而MDA水平则加剧升高;（6）PPARγ1-K77 SUMO化联合HFS饮食加剧上调血管组织中p-IKK的水平,并协同负性调控PI3K/Akt/e NOS信号通路。结论:细胞水平和动物水平均证实PPARγ1-K77 SUMO化联合高脂高糖应激可协同易化加重血管内皮IR效应。第五部分:机制探讨:PPARγ1-K77 SUMOylation与FOXO1相互作用协同调控血管内皮胰岛素抵抗目的:探讨PPARγ1-K77 SUMO化与FOXO1的相互作用协同调控内皮细胞IR的潜在分子机制。方法:以HUVECs为研究对象:1.Co-IP分析PPARγ1-K77 SUMO-1与FOXO1的相互作用;2.CHIP分别检测PPARγ1-K77 SUMO-1及FOXO1与靶基因启动子PPRE序列的结合能力;3.荧光素酶报告基因实验检测PPARγ1-K77SUMO-1转录活性;4.western blot分析FOXO1的磷酸化水平;5.激光共聚焦观察FOXO1的“核浆穿梭”;6.分离胞核和胞浆蛋白组分,分别行western blot,分析FOXO1在胞核-胞浆中的分布比例。结果:1.Co-IP结果表明PPARγ1-K77 SUMO化后与FOXO1互作增强;2.CHIP结果表明PPARγ1-K77 SUMO化后其与靶基因启动子上PPRE结合能力减弱,但FOXO1与靶基因启动子上PPRE结合能力增强;3.荧光素酶报告基因结果表明PPARγ1-K77 SUMO化可抑制PPARγ1的转录活性;4.PPARγ1-K77 SUMO化可抑制FOXO1的磷酸化,进而阻碍FOXO1由细胞核转位至细胞浆。结论:SUMO化PPARγ1-K77更易与FOXO1相结合,FOXO1竞争性占据PPRE结合位点,从而抑制PPARγ1的转录活性。第六部分:SENP1介导的PPARγ1去SUMO化逆转高脂高糖应激诱导血管内皮细胞胰岛素抵抗目的:探索PPARγ1-K77去SUMO化是否逆转高脂高糖应激诱导血管内皮细胞的IR效应,为糖尿病血管并发症的防治提供实验依据。方法:分别提取正常SD大鼠的RTAECs及HFS饮食诱导IR模型大鼠的RTAECs离体培养,通过构建Ad-SENP1过表达腺病毒载体感染细胞,水解PPARγ上的SUMO-1蛋白以观察PPARγ1-K77去SUMO化效应对血管内皮细胞IR的影响。1.Western blot检测SENP1的表达,Co-IP和western blot检测PPARγ的SUMO化水平;2.分别检测细胞培养上清液中NO和ET-1的水平;3.western blot分析p-IKK/IKK、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-e NOS/e NOS的水平;4.DCFH-DA细胞内活性氧检测探针检测细胞内活性氧ROS的生成水平。结果:1.SENP1过表达可逆转HFS诱导的PPARγ的SUMO化水平;2.PPARγ1-K77去SUMO化可以逆转HFS诱导的NO降低和ET-1升高的效应;3.PPARγ1-K77去SUMO化可下调IKKα/β磷酸化水平并激活PI3K-Akt-e NOS信号通路;4.PPARγ1-K77去SUMO化可降低HFS应激诱导的ROS生成量。结论:原代细胞水平证实SENP1介导的PPARγ1-K77去SUMO化可改善高脂高糖应激诱导的血管内皮IR效应。