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第一章 大鼠成骨细胞的体外培养和鉴定 目的：从正常新生大鼠颅骨中分离培养大批成骨细胞并进行功能鉴定，为进一步研究作准备。 方法：将新生SD大鼠处死，无菌条件下取出颅骨，剔净后剪成1mm×1mm×1mm碎块，0.1％胶原酶Ⅱ消化15分钟，碎骨块接种于培养瓶中培养，通过观察细胞形态学及钙化结节、碱性磷酸酶染色进行鉴定。 结果：用改良组织块法分离的大鼠成骨细胞，在体外培养时可维持其在体内的功能：合成碱性磷酸酶，最终能形成矿化结节。 结论：用改良组织块法进行大鼠成骨细胞培养，方便易行，可分离、培养大量高纯度成骨细胞，在体外传代后仍保留其表型特征，可供进一步研究使用。 第二章 尼古丁对体外培养成骨细胞骨桥蛋白表达的影响 目的：探讨尼古丁对体外培养大鼠成骨细胞骨桥蛋白表达的影响。 方法：取第四代体外培养大鼠成骨细胞，当传代细胞生长至80％汇合时，分三组分别加入尼古丁、尼古丁和阿曲库铵苯磺酸盐(筒箭毒碱)及空白，继续培养48小时。收集细胞按异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取细胞总RNA，RT-PCR分析各组成骨细胞表达OPN mRNA的差异。提取总蛋白，Westem blotting法测定蛋白表达水平，免疫沉淀法检测蛋白磷酸化程度。 结果：尼古丁干预组RT-PCR条带光密度值的OPN／β-actin比值(1.35±0.08)高于对照组(0.99±0.08)及尼古丁+阿曲库铵苯磺酸盐干预组(1.03±0.09)，差异有显著性(P＜0.05)；尼古丁组OPNWestern blotting的条带光密度值(161.98±9.00)高于尼古丁+阿曲库铵苯磺酸盐干预组(151.10±7.99)及对照组(147.74±4.99)，其差异有显著性(P＜0.05)；尼古丁组OPN免疫沉淀的条带光密度值