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[目的]
观察体外鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞诱导分化过程中端粒酶的变化,了解分化过程中端粒酶逆转录酶与端粒酶的关系,为临床进行神经元样细胞应用提供理论基础。
[方法]
1.取SD大鼠骨髓,密度梯度离心和贴壁法分离和纯化BMSCs,原代培养后传代,观察细胞形态特征,绘制生长曲线,流式细胞仪鉴定其表面抗原。
2.取第3至5代培养的鼠骨髓间充质干细胞,应用β-巯基乙醇,二甲基亚砜/丁羟茴香醚/依达拉奉(DMSO/BHA/EDR)联合诱导法诱导其向神经元样细胞分化,观察诱导分化后细胞形态变化,免疫细胞化学方法检测细胞NSE、GFAP表达,TRAP-ELISA法检测鼠骨髓间充质干细胞诱导前后端粒酶下活性的变化,RT-PCR检测BMSCs分化前后TERT基因mRNA表达,Western blotting检测BMSC分化前后TERT蛋白表达。
[结果]
1.密度梯度离心和贴壁法分离、纯化培养的hBMSCs呈梭状,具有均质性好,细胞增值活力强、传代生长快的特点。流式细胞仪检测BMSCs表面抗原,结果显示CD29、CD44、CD105阳性,CD34、CD45阴性;
2.经DMSO/BHA/EDR诱导分化后大部分细胞表现为富有突起的锥状细胞,突起延伸交织成网,呈现典型神经元样细胞,NSE阳性细胞率高表达,GFAP在实验组中弱表达。TRAP-ELISA结果显示诱导4h前细胞端粒酶活性性变化不明显,当诱导6h以后细胞端粒酶活性明显降低,诱导至24 h时,细胞端粒酶活性已近阴性(P<0.05),RT-PCR试验和Western blotting试验的结果与细胞端粒酶活性的改变一致。
[结论]
骨髓间充质干细胞在体外成功诱导分化为神经元样细胞的过程中端粒酶活性逐渐降低直至消失,端粒酶活性在诱导分化早期是高表达。