食管癌是我国高发的恶性肿瘤之一,具有地域分布差异性。其中,食管鳞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）和食管腺癌（Adenocarcinoma）是其常见的两种病理类型,我国90%以上患者为鳞癌。由于食管癌起病隐匿,早期症状不典型,多数患者诊断时即为中晚期,常伴有肿瘤局部浸润或远处转移也因此失去了手术机会,只能使用放、化疗等综合治疗手段,但治疗效果不佳,患者5年生存率较低。近年来靶向治疗在多种恶性肿瘤的临床应用中有着较大进展,但目前针对食管鳞癌的靶向治疗策略较为缓慢,因此,需进一步揭示食管鳞癌病变的调控机制,从分子水平上筛选潜在的生物标志物和治疗靶点以期能减缓食管鳞癌的恶化进展,这作为目前治疗食管鳞癌的策略之一,对改善食管鳞癌患者预后具有重要的临床价值和意义。Kruppel 样因子 5（Kruppel-like factor 5,KLF5）是 KLF 家族的关键成员之一。生理情况下KLF5可广泛参与调控包括增殖、分化、炎症、迁移等重要细胞功能,但异常表达的KLF5被证实可作为转录激活因子或抑制因子通过影响细胞内下游基因的表达,导致细胞增殖、细胞周期、分化、血管发生等生物学进程紊乱,最终诱发肿瘤的形成,因此可作为一个潜在的分子标志物和治疗靶点。但目前对KLF5在食管鳞癌中扮演怎样的角色,其上下游调控机制又是如何尚未完全阐明。既往报道证实KLF5作为一个非稳定性蛋白,其稳定性及活性可被多种蛋白质翻译后修饰调控,其中泛素蛋白酶体途径（ubiquitin proteasome pathway,UPP）作为蛋白质功能的经典调节途径,研究显示泛素化介导的蛋白降解过程与去泛素化修饰的动态平衡与KLF5蛋白水平的表达调控密切相关,由此我们推测食管鳞癌中KLF5蛋白水平不仅与KLF5的转录和翻译过程有关,翻译后修饰过程对KLF5功能维持同样发挥着不可忽视的作用。既往三阴性乳腺癌的研究显示去泛素化酶BAP1可通过去泛素化作用增加KLF5蛋白稳定性,上调靶基因TNFAIP2（TNF alpha induced protein 2）表达从而促进乳腺癌增殖、侵袭及转移,而BAP1或KLF5敲低可降低三阴性乳腺癌细胞在裸鼠体内成瘤能力,抑制其肺转移,提示BAP1可能通过去泛素化途径及靶向结合双重途径影响KLF5表达,但食管鳞癌中BAP1是否参与KLF5蛋白表达调控目前尚不清楚。综上所述,本课题中我们探究了 KLF5在食管鳞癌发生、发展中的潜在作用,揭示了 KLF5介导下游信号对食管鳞癌的影响,重点分析了 BAP1对KLF5的调控作用及机制以期为食管鳞癌诊治提供新靶点。第一部分 KLF5在食管鳞癌组织中的表达及临床意义研究目的:利用UALCAN数据库资源及本单位收集的食管鳞癌组织样本,分析KLF5在食管鳞癌及癌旁正常组织中的表达情况,探究KLF5与食管鳞癌临床病理特征的相关性。研究方法:1.利用UALCAN数据库分析KLF5在癌旁组织及鳞癌组织中的表达情况;2.收集食管鳞癌组织标本,通过免疫组织化学法检测组织标本中KLF5蛋白表达水平,根据染色强度和染色阳性率进行综合判断,将组织标本分为KLF5低、中、高表达组;应用卡方检验评价KLF5蛋白表达量和食管鳞癌患者临床病理特征的相关性。研究结果:1.UALCAN数据库分析食管癌中KLF5 mRNA表达情况UALCAN数据库分析证实食管鳞癌、腺癌中KLF5 mRNA表达显著升高（P＜0.05）。2.生物信息学分析KLF5 mRNA表达与食管癌患者预后的关系Kaplan-Meier生存分析显示KLF5 mRNA水平与食管癌患者OS无相关性。3.食管鳞癌组织中KLF5的表达情况47例食管鳞癌组织经免疫组化分析,结果显示KLF5主要分布于食管鳞癌肿瘤组织细胞核,为棕黄色及棕褐色颗粒状着色;低表达KLF5（scores 0～1）占比为44.7%,中、高表达KLF5（scores 2+～3+）占比为55.3%;4.KLF5在食管癌组织中的表达与临床病理参数之间的相关性KLF5蛋白表达水平与肿瘤分化程度（p=0.0012）、局部淋巴结转移（p=0.037）相关（p＜0.05）,而与患者年龄（p=0.970）、性别（p=0.529）、肿瘤位置（p=0.621）、病理分级（p=0.134）之间无显著的统计学相关性。研究结论:食管鳞癌发生过程中KLF5蛋白可能具有癌基因作用,其高表达与食管鳞癌恶性转移相关。第二部分 BAP1对KLF5调控作用探究研究目的:分析食管鳞癌组织中BAP1表达水平,探索BAP1过表达及敲低对食管鳞癌细胞生物学功能的影响,揭示BAP1对KLF5及其下游通路的调控作用及机制。研究方法:免疫组化法评价BAP1在食管鳞癌组织中的表达情况,构建BAP1过表达及抑制表达的ESCC细胞系,通过体外CCK8增殖实验评价BAP1对ESCC细胞增殖能力的影响,通过划痕实验比较BAP1对ESCC细胞迁移能力的影响,利用Western-blotting及挽救实验验证BAP1对KLF5信号通路的调控作用,双荧光素酶报告及Co-IP评价BAP1与KLF5的互作关系,去泛素化酶抑制剂PR619作用于BAP1过表达的Eca109细胞系后,观察KLF5蛋白的表达情况。研究结果:1.食管鳞癌组织中BAP1的表达BAP1在食管鳞癌组织细胞质和细胞核中均有表达,以细胞核为主,47例患者组织中有34例检测到BAP1表达（72.3%）,其中中、高表达23例（48.9%）,低表达 11 例（23.4%）;2.BAP1敲低对食管鳞癌细胞生物学特性的影响BAP1 siRNA处理后可显著下调食管癌细胞BAP1表达（p＜0.05）;CCK8细胞增殖实验表明BAP1干扰后食管鳞癌细胞增殖能力明显减弱,划痕结果表明,干扰BAP1可抑制食管鳞癌细胞迁移能力（p＜0.05）。3.BAP1过表达对食管鳞癌细胞生物学特性的影响BAP1过表达后,食管鳞癌细胞系中BAP1 mRNA水平较前显著升高（p＜0.05）,与对照组细胞相比,BAP1过表达后可显著增强食管鳞癌细胞的增殖能力（p＜0.05）;Transwell迁移实验显示,与对照组相比,BAP1过表达的食管鳞癌细胞迁移能力显著增强（p＜0.05）。4.BAP1对KLF5及下游靶基因调控作用应用Western-blotting检测Eca 109细胞过表达或敲低BAP1后KLF5、FGF-BP1、Cyclin D1表达变化,结果显示BAP1过表达可增强KLF5、FGF-BP1、Cyclin D1 的表达;敲低 BAP1 可下调 KLF5、FGF-BP1、Cyclin D1 的表达（p＜0.05）,提示BAP1可通过调控KLF5及其下游通路影响食管鳞癌细胞的生物学特性。5.“挽救实验”辅助验证BAP1通过靶向调控KLF5促进食管鳞癌细胞生长设计“挽救实验”,即通过在Eca109细胞中共转染BAP1和KLF5,观察食管鳞癌细胞增殖能力的变化情况,结果显示BAP1+siNC组细胞增殖活性显著提高,而BAP1+siKLF5组细胞增殖活性降低,差异有统计学意义（p＜0.05）,表明KLF5敲低可影响BAP1过表达对食管鳞癌的促增殖作用。6.BAP1与KLF5互作分析双荧光素酶报告结果显示BAP1不能直接结合到KLF5的启动子区影响其转录活性,提示BAP1促进KLF5转录是通过间接途径实现的;Co-IP/WB证实生理状态下BAP1可以与KLF5形成蛋白复合物。7.PR619及MG132干预实验辅助验证BAP1对KLF5的去泛素化作用设计PR619及MG132干预实验以探究BAP1对KLF5去泛素化作用,结果显示PR619干预后可下调BAP1过表达细胞中BAP1和KLF5蛋白水平,但MG132处理后BAP1过表达Eca109细胞BAP1和KLF5无明显变化,提示食管鳞癌中BAP1对KLF5的蛋白表达调控与去泛素化作用相关。研究结论:BAP1可调控KLF5表达影响食管鳞癌细胞增殖、侵袭及迁移等,且该过程与BAP1通过去泛素化作用维持KLF5稳定性有关。第三部分 食管鳞癌细胞中KLF5生物学作用及下游靶基因探究研究目的:构建KLF5表达干预的食管鳞癌细胞系,探究其对食管鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为的影响,明确KLF5对FGF-BP1-Snail2信号轴的调控作用。研究方法:构建KLF5过表达或敲低ESCC细胞,通过体外CCK8增殖实验评价KLF5对ESCC细胞增殖能力的影响;通过Transwell实验、划痕实验考察KLF5对ESCC细胞侵袭、迁移能力的影响;并通过生物信息学分析及CHIP、双荧光素酶报告实验证实KLF5可通过FGF-BP1-Snail2信号轴调控EMT途径促进食管鳞癌的进展。研究结果:1.过表达KLF5对食管鳞癌细胞生物学功能的影响选择KYSE-150、KYSE-140、Eca109细胞建立KLF5过表达的ESCC细胞系,Western-blotting及 PCR检测显示过表达后 KYSE-150、KYSE-140、Eca109细胞系中KLF5水平明显升高（p＜0.05）,提示KLF5过表达细胞系构建成功;CCK8法显示KLF5过表达后可显著增强KYSE-150、KYSE-140、Eca109细胞增殖能力（p＜0.05）;与对照组相比,过表达KLF5可增强ESCC细胞侵袭及迁移（p＜0.05）。2.敲低KLF5对食管鳞癌细胞生物学功能的影响Western-blotting及PCR结果显示,KLF5沉默后KLF5的表达水平下降（p＜0.05）;CCK8实验表明KLF5表达下调可致ESCC细胞增殖抑制（p＜0.05）;Transwell及划痕实验证实,KLF5沉默可抑制ESCC细胞迁移和侵袭能力（p＜0.05）。3.KLF5通过调控FGF-BP1、Snail2影响食管鳞癌细胞侵袭迁移纳入TCGA数据集分析结果显示食管癌KLF5与FGF-BP1的mRNA表达呈正相关（r=0.36,P=7.2×10-7）,进一步分析GEO数据库中的食管鳞癌患者肿瘤组织芯片数据集GSE16355和GSE44021,证实食管鳞癌中KLF5与FGF-BP1 mRNA表达水平呈正相关（p＜0.05）,并发现FGF-BP1与Snail2表达呈正相关（p＜0.05）;Western-Blotting分析证实KLF5表达干预可影响FGF-BP1及Snail2水平,提示KLF5可通过FGF-BP1-Snail2信号轴影响食管鳞癌细胞的生物学功能。4.KLF5结合到FGF-BP1启动子区,直接促进其表达ChIP-qPCR检测证实KLF5可与FGF-BP1启动子结合,但是KLF5只能结合至预测位点1上,对该结合位点进行定点突变,双荧光素酶报告基因实验证实FGF-BP1是KLF5的直接靶基因。5.“挽救实验”辅助验证FGF-BP1对Snail2的表达调控作用为了进一步明确Snail2是FGF-BP1的功能靶点之一,设计“挽救实验”,即将FGF-BP1过表达质粒和Snail2 siRNA共转染至Eca109细胞观察食管鳞癌细胞增殖变化情况,结果显示FGF-BP1+siNC组细胞增殖活性显著提高,而FGF-BP1+siSnail2组细胞增殖活性降低,差异有统计学意义（p＜0.05）,表明Snail2敲低可阻断FGF-BP1过表达对食管鳞癌细胞促增殖作用。研究结论:KLF5可通过调控FGF-BP1-Snail2信号轴影响ESCC的侵袭、迁移。