研究背景GTP环化水解酶Ⅰ(GCH-1)是四氢生物蝶呤(BH4)生物合成过程中的第一个催化酶,也是重要的限速酶。而BH4又是芳香族氨基酸羟化酶,一氧化氮合酶(NOS)亚基和甘油醚单加氧酶的一种重要的辅助因子。GCH-1突变导致的BH4缺乏已被证明会引起苯丙酮尿症和多巴反应性肌张力障碍(DRD)。因此,BH4在调节NOS活性中起到至关重要的作用。已有文献指出BH4有助于将NOS血红素铁转化成高自旋状态,并且可以增加NOS与精氨酸酶的亲和力。BH4还有利于NOS还原酶的电子传递,以及稳定NOS的二聚体结构。当BH4产生受限时,NOS催化的O2与L-精氨酸的耦合减少,致使NOS催化产生的超氧阴离子自由基(02··-)增多,而一氧化氮(·NO)并未增多。此外,值得注意的是,BH4还容易被氧化为二氢生物蝶呤(BH2),而这种氧化产物对NOS没有任何辅助作用。目前研究已发现,BH4的减少(被消耗或被氧化)与高血压,动脉硬化,糖尿病,心肌肥厚,以及心肌缺血有关。而且,无论在体内还是体外实验中都已证实,GCH-1在心血管生理中对调节BH4的产量和NOS的活性发挥了重要作用。此外,在内皮细胞实验中,GCH-1转基因可以使BH4产量比基础水平增加10倍以上,同时伴随着依赖内皮型NOS(eNOS)催化而产生的·NO的显著增加。在转基因小鼠的血管内皮细胞中过表达人类GCH-1后,小鼠血管内皮的BH4产量升高3倍,同时02··-产量明显降低。因此,与野生型小鼠比较,GCH-1转基因小鼠很好的维持了·NO的生物利用度。但也有文献指出,转基因小鼠中eNOS的过表达可以增加依赖eNOS的O2·-产生,然而有趣的是,当eNOS转基因小鼠与GCH-1转基因小鼠杂交时,O2`-产量又降至正常水平。大量研究表明,GCH-1可能被磷酸化作用精细地调节着。GCH-1的磷酸化在受到血管紧张素Ⅱ,血小板衍生的生长因子或蛋白激酶C(PKC)激活剂佛波酯(TPA)刺激的细胞内是增加的,而且GCH-1磷酸化的增加趋势与GCH-1的活性和BH4的产生是一致的。同时,过表达的GCH-1是以磷酸化形式存在于肥大细胞中,并且TPA可以刺激肥大细胞中的GCH-1发生磷酸化以及刺激BH4的产生,而这一过程能够被PKC抑制剂所抑制。最近,一项用人类内皮细胞做的实验表明,剪切应力可以激活酪蛋白激酶Ⅱ，从而增加GCH-1的丝氨酸-81位点的磷酸化程度,并提高GCH-1的活性。虽然GCH-1的磷酸化程度可以调节其活性,但是对这些潜在的磷酸化位点是如何调节GCH-1活性的系统性研究尚无报道。研究目的GCH-1是BH4生物合成过程中的限速酶,它的突变所导致的BH4的缺乏可引起多种疾病。但目前对GCH-1翻译后的调节机制尚缺乏认识。因此,本研究的目的是找出潜在的GCH-1磷酸化位点,并确定这些特殊磷酸化位点的功能特性。研究方法1.质粒的构建：GCH-1的cDNA来自SD大鼠,将cDNA克隆到pcDNA5/FRT/TO/Topo/TA载体中。为了纯化GCH-1蛋白,在其N末端加入FLAG序列。然后,以FLAG-GCH-1为模板,合成FLAG-GCH-1去磷酸化突变体(丝氨酸／苏氨酸[S/T]突变为丙氨酸[A])或模拟磷酸化突变体([S/T]突变为谷氨酸[E]或天门冬氨酸[D])。FLAG-GCH-1突变体被命名为S51A、S51E、S51D等。同时,本课题还构建了GCH-1绿色荧光蛋白(GCH-1-GFP)和T231A-GCH-1绿色荧光蛋白(T231A-GCH-1-GFP)。2.稳定的细胞株：FLAG-GCH-1和它的突变体与POG44共转染到Flp-InTMT-RExTM-293细胞中建立稳定的细胞系。这些表达野生型(WT)或者突变体的细胞被命名为WT-GCH-1细胞、S51A-GCH-1细胞、S51D-GCH-1细胞等。在所有实验中,细胞用四环素(1μg/mL)刺激24小时来调控细胞内质粒的表达。3.质谱分析：Top-Down质谱用于分析HEK 293细胞中完整的FLAG-GCH-1片段。FLAG-GCH-1是从HEK293细胞中通过免疫沉淀纯化得到。FLAG-GCH-1经过脱盐后,引入ESI/FTMS系统进行质谱分析。Bottom-Up质谱方法需要将FLAG-GCH-1用胰酶消化。消化后产生的多肽混合物通过有C18分离柱的nano-2DLC色谱分析系统而彼此分离,然后用在线LTQ MS仪进行分析。另外,Bottom-Up质谱法还要与胶内消化相配合。FLAG-GCH-1通过凝胶电泳将蛋白质在不同梯度上进行分离并被免疫沉淀。然后将GCH-1带切除、脱色和消化。由其产生的大量的肽段通过固相金属亲和色谱法找出磷酸化肽段,然后使用MALDI-TOF MS对磷酸化肽段进行分析。4.BH4和BH2是用高效液相色谱法(HPLC)测定。细胞用冷的PBS清洗2遍。将细胞刮下转入试管,离心得到的细胞经过裂解后再次离心,取上清液用于HPLC分析。BH4和BH2测定采用Synergia Polar-RP色谱柱检测,用氩饱和50mM磷酸盐缓冲液(pH 2.6)洗脱。多通道电量检测电压设置为0-600mV。根据0mV和150mV所得到的BH4峰值面积得出BH4的标准曲线,根据280mV和365mV所得到的BH2峰值面积得出BH2的标准曲线。通过BH4和BH2的标准品测定,可以计算出样品细胞内的BH4和BH2浓度。最后,通过细胞内的蛋白定量使BH4和BH2标准化。5.磷酸化位点预测。利用3种蛋白质磷酸化位点预测软件对GCH-1的磷酸化位点进行预测。PredPhospho软件：http://pred.ngri.re.kr/PredPhospho.htm;NetPhosK2.0软件：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/;Scansites软件：http://scansite.mit.edu/。6.通过免疫沉淀和蛋白印迹(western blot)检测GCH-1不同位点磷酸化水平及其细胞内的定位。研究结果1.质谱分析研究表明,在HEK293细胞里过表达的大鼠GCH-1,在其丝氨酸(S)51,S167,和苏氨酸(T)231位点发生了磷酸化。而结合计算机分析结果,共发现了GCH-1共有8个潜在磷酸化位点,即S51、S72、T85、T91、T103、S130、S167和T231。2.当细胞内转染S72A、T85A、T91A、T103A和S130A去磷酸化突变体时,GCH-1的活性和BH4的产量明显降低；但是当细胞内转染去磷酸化突变体T231A时,GCH-1的活性和BH4的产量却明显增加。3.BH4和BH2的产量在转染S51E、S72E、T85E、T91E、T103D和T130D突变体的细胞中是显著升高的,但在转染T231D突变体的细胞中是降低的。4.在转染S167A和S167E突变体的细胞中,BH2的产量也是增加的。5.此外,本研究还发现细胞中转染T231A突变体后可以降低GCH-1的细胞核定位以及细胞核内GCH-1的活性。结论通过本实验,我们确定了8个GCH-1的潜在磷酸化位点,并鉴定了这些位点对GCH-1的活性、BH4和BH2的生物合成,以及GCH-1的定位作用。我们首次发现了GCH-1活性是受多个磷酸化位点调控的,其中S51,S72,T85,T91,T103和S130位点的磷酸化起到正性调节作用,而T231位点的磷酸化起到负性调节作用。此外,该研究还首次提出了S51，T231和S167位点的磷酸化对GCH-1活性调节的重要性。这一发现将会为提高BH4生物利用度提供新的思路。本课题的研究结果将有助于进一步认识在BH4产生过多或过少情况下,细胞水平的调节机制,尤其是该机制在心血管疾病和神经系统疾病(如高血压、冠心病、糖尿病和肌张力障碍性疾病等)中的作用。研究背景内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁的组成成份,其化学本质为脂多糖(LPS),为细菌死亡或活跃繁殖时所释放。LPS本身无毒性作用,但能够刺激体内多种细胞合成并释放众多内源性生物活性因子。巨噬细胞积极地参与了宿主防御和炎症过程。当机体暴露于革兰氏阴性菌时,巨噬细胞被细菌细胞壁上的脂多糖激活,从而引发大量·NO和炎性细胞因子的释放。大量产生的·NO的衍生物可以破坏细菌,但也可以引起宿主组织损伤和毒性作用。·NO是在至少3种NOS的催化下产生的,其中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)也称为NOS2。iNOS的作用是促进巨噬细胞在LPS刺激下产生大量的·NO。通过与Toll-like receptor 4(TLR4)的相互作用,LPS可以激活细胞内信号通路,包括有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)和核因子κB(NFκB)通路,同时可以上调巨噬细胞内iNOS的表达。NFκB通路是iNOS介导过程及炎症反应中最重要的信号通路。P50(NFκB1)／p65的(RelA)异源二聚体是NFκB最普遍存在的形式。各种炎症刺激均可诱导NFκBp65(丝氨酸536)发生磷酸化反应,而p65的磷酸化是调节NFκB的激活、细胞核定位和转录活性的关键。BH4是NOS的一种重要的辅助因子,并且已被证明可以调节iNOS活性及iNOS依赖的·NO的产生。GCH-1是催化BH4生物合成中的第一步,且是该合成过程的限速酶。有资料显示,GCH-1转基因小鼠在LPS的刺激下,肾脏的iNOS的表达与NO含量显著提高。GCH-1的抑制剂可以明显抑制LPS诱导的NO·的产生和干扰素γ诱导的iNOS的表达。在本实验第一部分关于GCH-1磷酸化调节研究中,通过对GCH-1磷酸化位点的突变,将大鼠GCH-1的85位点苏氨酸(T85)突变为丙氨酸,使其去磷酸化而功能丧失,结果发现GCH-1活性和BH4产生能够被完全抑制。因为GCH-1的T85位点与周期序列依赖性蛋白激酶5(CDK5)有着相同的序列,所以我们提出的假设是CDK5被抑制后可能会抑制GCH-1磷酸化,从而抑制巨噬细胞内·NO的产生。然而,结果显示CDK5抑制剂roscovitine可以直接抑制LPS诱导的GCH-1表达(mRNA和蛋白水平)。研究目的根据预实验的结果,我们推测roscovitine抑制LPS诱导的NO·的产生是通过roscovitine沮止了BH4的生物合成及抑制了LPS激活的NFκB途径或MAPK途径。因此,本研究的目的是探讨在LPS刺激的巨噬细胞内,roscovitine对iNOS及GCH-1的表达、·NO的产生、BH4的生物合成以及NFκB途径和MAPK途径的抑制作用。研究方法在与炎症有关的疾病中,细胞内毒素的释放所导致的·NO和细胞因子产生过多与组织损伤之间有至关重要的关系。因此,我们用LPS刺激小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞,探究了不同浓度roscovitine对小鼠巨噬细胞中一氧化氮产生的抑制作用的区别。为了确定roscovitine是否有潜在的细胞毒性作用,首先分别用1μM,10μM and 25μM的roscovitine处理RAW 264.7巨噬细胞24个小时,细胞的存活力用MTT方法检测。然后用roscovitine(1μM,10μM and 25μM)预处理巨噬细胞30min,随后用LPS(2μg/m1)刺激12小时后检测巨噬细胞中·NO的产量,并且应用HPLC检测BH4和BH2的产量。为了明确roscovitine对NFκB信号通路的抑制作用,将经过roscovitine干预后的巨噬细胞用LPS刺激,提取其中的RNA和蛋白质,并通过RT-PCR和western blot方法检测NFκB途径和MAPK途径的蛋白酶活性及其表达水平,并与未经roscovitine干预的对照组进行了比较。同时我们也检测了可以调节IκB磷酸化的上游激酶IKK。其次,本实验还分析了受NFκB活性影响的特殊基因(如COX-2,IL-1p,IL-6和TNFα)的表达。再次,由于文献报道roscovitine对CDK1,CDK5和CDK7均有抑制作用,我们用不同种类和不同浓度的CDK抑制剂干预巨噬细胞,从而确定是哪种CDK起作用。最后,考虑到实验用的RAW264.7巨噬细胞系并不能完全代表未经修饰的巨噬细胞,我们又分离了大鼠腹腔巨噬细胞进一步验证了roscovitine对LPS诱导的炎性反应的抑制作用。研究结果1.在RAW264.7巨噬细胞中,roscovitine能够抑制LPS诱导的·NO的产生,并明显抑制了由LPS诱导的iNOS的mRNA和蛋白质表达。2.结果显示,roscovitine能够抑制LPS诱导的NFκB活性。同时,roscovitine减弱了LPS诱导的IKKβ、IKB和p65的磷酸化,但增强了ERK、P38和JNK的磷酸化程度。3.RT-PCR实验结果显示LPS明显增加了IL-1β和IL-6的mRNA表达,而当roscovitine剂量为10“M和25μM时,对上调的IL-1β和IL-6有显著的抑制作用,并呈剂量依赖性。但结果显示,roscovitine对LPS诱导的TNFα表达上调没有抑制作用。4.Roscovitine增强了LPS诱导的MAPK活性。Roscovitine不仅对LPS诱导的ERK活性的增加没有抑制作用,相反,roscovitine还使ERK磷酸化程度在LPS刺激后的30min和60min时变得更强。与ERK结果相似,roscovitine增强了LPS刺激后15min和30min时的p38磷酸化程度,同时也增强了LPS刺激后0min和180min时的JNK磷酸化程度。5.经过12个小时LPS的刺激,细胞内BH4的产量高于正常水平的6倍。Roscovitine可以极大程度地抑制LPS诱导的BH4水平的增高,甚至使BH4水平降至低于对照组水平。同时,roscovitine也显著降低了BH4/BH2比值,而这个比值对NOS聚合活性的影响有着与总BH4浓度同样的重要性。此外,LPS也明显增加了GCH-1mRNA和蛋白质的表达,而roscovitine预处理后显著抑制了LPS诱导的GCH-1的表达。6.我们使用其他CDK抑制剂发现,CDK1,CDK 5和CDK7抑制剂明显抑制了LPS诱导的巨噬细胞中·NO产生,但CDK2的抑制剂对其无明显抑制作用。7.在分离的大鼠腹腔巨噬细胞中,roscovitine显著地抑制了·NO的生成、iNOS和COX-2的表达、NFκB的活性,以及LPS诱导的GCH-1表达的增加。结论1.实验结果表明,roscovitine能够通过抑制NFκB的激活和BH4的生物合成,抑制LPS诱导的巨噬细胞内·NO产生。而这种抑制作用可能是由CDK1,CDK5和CDK7所介导的。2.研究结果还证实了roscovitine可以抑制炎症,而CDKs在其抗炎机制中起到了重要的作用。3.此外我们发现,roscovitine对LPS诱导的MAPK的活性没有抑制作用,相反是加强作用。这说明MAPK可能没有参与roscovitine对LPS诱导的iNOS和·NO产生的抑制过程。