酒精滥用和酒精依赖已成为当今世界上日益严重的公共卫生问题，特别是青少年饮酒更值得人们重视。肝脏是酒精吸收后的主要代谢场所，也是毒害的主要靶器官。乙醇对肝细胞的损伤，涉及多种机制，但氧化损伤是其共同的早期改变，主要表现为：活性氧(ROS)大量产生，氧化-抗氧化系统失衡，脂质代谢紊乱，生物大分子氧化变性与加合物形成，最终导致细胞结构与功能的紊乱。 姜黄素是一种天然的抗氧化物质，属于多酚类化合物，几乎无毒，其不仅在食品体系显出很强的抗氧化活性，而且在生物体内也显出较强的抗氧化性。最近，有学者发现它能抑制许多与过氧化相关的疾病，于是它在生物体内的抗氧化性引起人们的注目。其广泛的生物活性包括抗炎、抗氧化、抗诱变，降血脂及抗动脉粥样硬化，抗肿瘤(拮抗致癌过程中所造成的DNA损伤作用)等等。姜黄素不仅本身具有抗氧化活性，还能清除自由基，提高自由基清除剂含量和诱导抗氧化酶活性。 HO-1基因的诱导主要在转录水平被调节。已经确定的是，在HO-1基因启动子上游发现有多个抗氧化剂反应元件(antioxidant-responseelement，ARE)，目前发现的ARE结合蛋白有Nrf2和MafK，前者在氧化剂刺激下激活，而后者正相反。Nrf2的活性通常在胞质中通过一种与伴侣蛋白Keap1结合而被抑制。但是，当拥有修饰巯醇基能力的亲电子基团或者化合物的不断积聚，Keap1对Nrf2活性的抑制就消失了，Nrf2易位进入核内，作用于ARE。 姜黄素还是血红素氧化酶-1(HO-1)的天然诱导剂。在机体内源性抗氧化系统中，Ⅰ型血红素氧化酶(HemeOxygenase-1，HO-1)因其应激性、可诱导性和对多种氧化损伤(如缺血、缺氧、高温、辐射及外源性化合物等引起)良好的保护效应，近年来备受关注，成为预防氧化攻击的首选靶基因之一。HO-1系统被认为具有抗氧化、维持微循环、调节细胞周期及抗炎等功能。Motterlini等人最近证实在内皮细胞和神经细胞中HO-1可以被caffeicacidphenethylester(CAPE)和姜黄素诱导，因此，我们可以假设这些天然物质具有抗氧化的功效可能与它们可以激活HO-1途径有关。最近的研究也证实在极度的低氧环境中，正是由于姜黄素可以诱导内皮细胞HO-1表达，因此帮助细胞抵御氧化应激。 基于以上分析，我们假设姜黄素通过Nrf2/ARE信号通路诱导HO-1表达，进而表现出对酒精性肝损伤的保护效应。 研究目的： 本项目拟以大鼠原代肝细胞为研究对象，以HO-1为靶点，观察姜黄素对细胞的抗氧化保护作用，研究姜黄素诱导HO-1与Nrf2活化的分子机制。 研究方法： 本实验以原代大鼠肝细胞为研究对象，用含不同浓度酒精的培养基培养，于不同时间收集细胞，用酶学方法检测细胞培养上清液中LDH，GOT水平。用酶学、生化学等方法检测细胞内MDA，GSH及SOD活性。观察酒精对肝细胞氧化损伤的时间剂量效应，建立大鼠肝细胞氧化损伤模型。观察姜黄素对酒精诱导的肝细胞氧化损伤的保护作用。根据前面实验的氧化损伤模型参数，在使用酒精染毒细胞前，用姜黄素预处理肝细胞，观察姜黄素对肝细胞保护的时间-剂量效应情况，测定指标同前，从而确定姜黄素对肝细胞氧化损伤的保护作用。为了证实HO-1/Nrf2途径在姜黄素抗氧化能力中的作用，使用HO-1经典诱导剂Hemin及抑制剂ZnPPⅨ作用肝细胞，梯度离心提取肝细胞微粒体，对比姜黄素组观察各组诱导HO-1活性的能力。在此基础上，使用westernblot方法检测姜黄素干预对肝细胞Nrf2蛋白表达影响，以及与MAPK各级联通路抑制剂共孵育后Nrf2蛋白表达水平的变化，研究姜黄素诱导HO-1与Nrf2活化的分子机制。 研究结果： 1、酒精对肝细胞的损伤程度与给予酒精的浓度以及作用时间呈正相关。随着酒精浓度的增加，肝细胞的活力逐渐降低，脂质过氧化程度不断加重，细胞内抗氧化酶水平不断下降，在100mmol/L时，影响程度明显。随着酒精作用时间的延长，相对于正常对照组，细胞活力降低、脂质过氧化程度加重，细胞内抗氧化酶水平降低，在8h时影响程度明显。 2、姜黄素能降低酒精诱导的肝细胞氧化损伤。在乙醇作用前，预先给予姜黄素进行干预，可明显减轻酒精所致的GSH消耗、抗氧化酶失活和脂质过氧化，提高细胞的代谢活力，促使失衡的抗氧化系统尽快恢复，对细胞酒精性氧化损伤表现出较强的保护效应。 3、姜黄素能够诱导HO-1发挥抗氧化作用。HO-1活性和表达与肝细胞的氧化抗氧化水平相关，抗氧化水平较好的15μmol/L预作用1h时，HO-1活性最高。姜黄素能诱导HO-1的活性和表达，在15μmol/L和6h时达到高峰。 4、ERK信号通路抑制剂PD980059、P38信号通例抑制剂SB203580以及JNK信号抑制剂SP600125不能抑制姜黄素诱导Nrf2蛋白的表达；而加入PI3K信号通路抑制剂wortmannin和LY294002后，能阻止姜黄素诱导Nrf2蛋白表达。 结论： 姜黄素对肝细胞有明显的保护作用，能部分对抗酒精对肝细胞的氧化损害，其主要表现在：提高细胞的活性；减少细胞损伤；提高细胞内抗氧化酶水平，降低脂质过氧化程度；提高细胞HO-1活性及表达水平。 HO-1在姜黄素发挥抗氧化作用中发挥重要作用，其作用机制与Nrf2途径有关。在细胞内传导通路中，PI3K是Nrf2易位至核内的主要方式。