研究背景慢性淋巴细胞白血病（chronic lymohocytic leukemia,CLL）是一种慢性淋巴细胞增殖性疾病,以成熟表型CD5+CD23+单克隆B淋巴细胞在外周血、骨髓、淋巴结和脾脏的长期大量聚集为特征。它是西方国家最常见的白血病类型,约占所有白血病病例的1/3,近年来CLL在我国发病率也逐渐升高。临床表现主要为外周血淋巴细胞增多、肝脾及淋巴结肿大,晚期可发展为骨髓衰竭。目前对于CLL的发病机制研究发现,在组织微环境的各种信号通路中,B细胞受体（B-cell receptor,BCR）的激活和信号通路对于恶性B细胞的增至和存活发挥了至关重要的作用。最直接的证据来源于比较基因表达谱数据,该数据表明在淋巴组织分离出的CLL细胞中,BCR信号通路是最显著激活的。Bruton酪氨酸激酶（Bruton’s tyrosine kinase,BTK）作为Tec激酶家族中的一员,在BCR信号通路中占据核心地位。它主要表达于发育中的各期B细胞,不表达于T细胞和浆细胞。一般认为BCR受到抗体刺激激活后,Btk被其它酪氨酸激酶如Lyn和Syk所激活,活化的Btk可通过进一步激活PLCγ,PLCγ可催化细胞膜上的二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）水解生成三磷酸肌醇（IP3）和二酰基甘油（DAG）,IP3和DAG作为第二信使发挥作用。IP3与内质网上的相应受体结合,促进细胞内钙库释放,使细胞内的钙离子浓度升高。而DAG与PKC结合,激活PKC,从而激活MAPK,MAPK可活化细胞核内的转录因子,从而调节基因转录;与此同时,PKC也可使IκB磷酸化,IκB发生泛素化降解,IκB和NF-κB解离,NF-κκ:B由胞浆转位至细胞核,结合相应靶序列,调控基因表达,影响B细胞的存活、增殖和分化。因此BTK在BCR信号通路中占据核心地位。也正因为其在BCR信号通路的重要作用,使其成为B细胞恶性肿瘤治疗的热门靶点Ibrutinib（PCI-32765）是一种不可逆、高度选择性和有效性的BTK抑制剂,其通过与BTK活性中心的半胱氨酸残基481（Cys-481）共价结合,不可逆地抑制BTK的激酶活性,从而抑制BCR信号的传导和B细胞的活化。Ibrutinib于2013年是获FDA批准上市,也是第一个用于临床的口服BTK靶向抑制剂。目前,其已获批4种适应症,套细胞淋巴瘤、难治性慢性淋巴细胞白血病（CLL）、染色体17缺失的CLL和巨球蛋白血症。通常情况ibrutinib耐受良好,但仍存在一些不良反应。最常见的副作用主要是出血、感染、血细胞减少、心房颤动、第二原发性恶性肿瘤、肿瘤溶解综合征、胚胎-胎儿毒性等。出现3或3级以上的出血事件（如硬膜下血肿,胃肠道出血,血尿和后程序出血）发生率达6%。目前,出血副反应的机制还不清楚,现认为服用ibrutinib所出现的出血事件主要是由血小板功能不全引起,理由如下:1出血的主要形式与原发的止血失败一致,轻微外伤后出现擦伤或皮下出血;2多中心研究通过对350例出血病人检测发现,传统的凝血指标如凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间并未出现异常;3接受ibrutinib治疗的病人的血小板呈现对胶原、糖蛋白IV（GPIV）特异性刺激源及胶原相关肽（CRP）-XL的缺陷反应,然而,对于其它血小板刺激物如ADP和U46619的反应并未受到影响或者只是轻微抑制。BTK是GPVI胶原受体信号通路的一个重要组成部分,ibrutinib通过抑制BTK从而抑制胶原刺激的信号通路。线粒体作为血小板细胞质中重要的细胞器,对于血小板的功能发挥着举足轻重的作用。过去很多年中,血小板中的线粒体被认为只是提供ATP,利用氧化磷酸化过程来满足静息血小板的能量需求。但近些年越来越多证据表明除了提供能量,线粒体还可调节血小板激活。用外源性过氧化氢处理血小板会引起激活,且细胞内活性氧（Reactive Oxygen species,ROS）作为内源性的第二信使参与胶原介导的血小板激活。现在大量的研究将血小板活化增加与线粒体超极化和ROS产生联系起来。然而,ROS的确切下游靶点目前仍不完全清楚,消除细胞内过氧化氢可激活细胞色素C和花生四烯酸代谢从而导致钙离子流动的抑制,ATP从颗粒中释放受损以及血小板凝集的缺陷。虽然血小板中存在多种ROS来源,线粒体的电子传递链产生大部分的超氧物质,而这些超氧物质可被超氧化物酶转化为过氧化氢。线粒体中ROS的产生与线粒体膜潜能的改变密切相关,因为随着膜潜能的增加,电子传递链还原增加,导致传递链的电子漏,产生超氧化物。染色体17p缺失是CLL中重要的基因改变,与化疗抵抗和不良预后相关。而抑癌基因p53位于人类第17号染色体上,p53信号通路在DNA损伤后可介导细胞的死亡,因此染色体17p缺失CLL的不良预后可能与抑癌基因p53的缺失相关。有趣的是,最近研究表明,染色体17p的缺失与残留p53等位基因的突变存在高度的一致性,约占CLL病人总体的7%-11.5%55-57。而且,p53的功能异常也会影响治疗效果,这也解释了一些CLL病人,即使p53没有结构上的异常,仍显示出不良的预后。目前,对于染色体17p缺失的CLL发病机制仍不清楚。一项研究检测CLL病人中148个miRNAs基因的DNA序列变化,结果表明不管是在家族性还是散发性的CLL中,均频繁出现miRNA DNA序列的改变,因此miRNA可能参与该种疾病的发生和发展。本课题利用CLL病人临床血液标本和巨核细胞MEG-01,探讨ibrutinib治疗慢性淋巴细胞白血病时抑制血小板凝集的分子机制,确定线粒体呼吸链和syk通路起着关键作用。同时,建立TCL1转基因且p53缺失的鼠模型（TCL1-Tg:p53-/-）模拟人类染色体17p缺失的CLL,并结合临床标本,分析miRNA表达谱变化。研究内容包括以下几个方面:1、ibrutinib对于血小板数量及巨核细胞的生长无显著影响。2、ibrutinib抑制胶原介导的血小板凝集。3、短时间的ibrutinib抑制血小板和巨核细胞的线粒体呼吸链活性和氧化代谢,从而影响血小板凝集。4、长时间的ibrutinib处理抑制线粒体呼吸链复合体I的表达和ROS生成。5、线粒体呼吸链在syk信号通路激活中发挥重要作用。6、TCL1-Tg:p53-/-动物模型和染色体17p缺失的CLL临床标本中,miR-15a和miR-16-1表达显著下降。通过本研究确定ibrutinib通过抑制线粒体呼吸链和syk通路的激活从而阻碍血小板凝集,染色体17p缺失、p53功能的异常可引起miRNA表达谱的显著改变。研究目的本课题利用CLL病人临床血液标本和巨核细胞体外分泌血小板,采用分子生物学和细胞生物学技术,探讨ibrutinib引起血小板凝集功能障碍的分子机制,确定ibrutinib通过抑制线粒体呼吸链和syk通路的激活从而阻碍血小板凝集。同时建立TCL1-Tg:p53-/-动物模型,发现染色体17p缺失、p53功能的异常可引起miRNA表达谱的显著改变。通过本项目研究,明确ibrutinib引起血小板凝集功能障碍的分子机制,为预防出血副反应提供靶点。同时进一步探讨染色体17p缺失CLL的发生发展机制。研究方法1.细胞培养人巨核细胞株MEG-01培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中,37℃C、5%CO2、饱和湿度的条件下,每周传代2-3次。2.源于体外巨核细胞的血小板的收集从培养瓶中吸取所有细胞培养基,移至离心管中,离心150g 10分钟,细胞沉淀在离心管底部,将上清吸出移入另一个离心管中,离心500g 10分钟,再将上清吸出移入另一个离心管中,离心1000g 10分钟。去掉上清液,血小板沉淀在离心管底部,加入 Tyrode’s buffer（134 mM NaCl,12 mM NaHC03,2.9 mM KC1,0.34 mM Na2HP04,1 mM MgC12,10 mM Hepes,pH 7.4）重悬血小板。3.从病人血液标本中收集血小板将病人血液从采集管中用宽口的移液管吸出转移至一个塑料管中,离心200g 20分钟,室温,减速度为0;离心后,血液出现分层,最上面一层为血小板富集血浆（platelet rich plasma,PRP）,用宽口移液管将PRP吸出移至另一个塑料管中,注意不要碰到下面的棕黄色层以免造成污染;离心100g 15-20分钟,室温,将PRP混入的红细胞、白细胞沉淀下去;将上清用宽口移液管吸出移至另一个塑料离心管中,离心800g 15-20分钟,室温,减速度为0。血小板沉入管底,去掉上清。缓慢小心地用 Tyrode’s buffer（134 mM NaCl,12 mM NaHC03,2.9 mM KCl,0.34 mM Na2HP04,1 mM MgC12,10 mM Hepes,pH 7.4）containing 5 mM glucose and 3 mg/ml BSA重悬血小板沉淀,待后续使用。4.ibrutinib 的给药短时间给药:从临床慢性淋巴细胞白血病病人的血液标本中提出PRP,加至24孔板中,再加入ibrutinib使得终浓度为0.5μM,室温孵育30分钟。再进行后续检测。给予MEG-01细胞培养液加入ibrutinib使得终浓度为0.5μμM,37℃C孵育60分钟。再将培养液中分泌的血小板与MEG-01细胞分离,再进行后续检测。长时间给药:给予MEG-01细胞培养液加入ibrutinib使得终浓度为0.5μM,37℃C孵育3天。再将培养液中分泌的血小板与MEG-01细胞分离,再进行后续检测。5.流式细胞术检测血小板的生成CD41a是整合素α Ⅱib或血小板GPIIb。钙离子依赖性的CD41/CD61复合物正常表达于血小板和巨核细胞上,该复合物是纤维蛋白原、纤连蛋白和血管性假血友病因子的受体,且介导血小板粘附和聚集。是血小板特异性的表面抗原标志物。CD49b是整合素α 2链（VLA-α 2）,为泛特异性血小板的表面抗原标志物。收集MEG-01细胞至离心管中,离心150g 10分钟;细胞沉淀在离心管底部,将上清吸出移入另一个离心管中,离心500g 10分钟;再将上清吸出移入流式管中,离心1000g 10分钟。去掉上清液,血小板沉淀在流式管底部,加入3ml PBS（含2%FBS）重悬血小板,离心1000g 10分钟。去掉上清液;加入250ul PBS（含2%FBS）重悬血小板,加入1Oul PE mouse Anti-human CD41a和1Oul FITC mouse Anti-human CD49b,避光4摄氏度孵育20-30分钟;重新加入250ul PBS（含2%FBS）至血小板中,离心1000g 10分钟。去掉上清液;加入250ul PBS（含2%FBS）重悬血小板,上机检测。6.血小板凝集试验酶标仪检测血小板凝集样本的收集:临床样本及细胞样本中血小板的收集见前,收集后Tyrode’s Buffer重悬血小板,测定血小板浓度,将终浓度调制2×108血小板/ml。将血小板溶液加入96孔板中,100ul/孔,即2×107血小板/ml;仪器设定:酶标仪温度为室温,吸光度405nm;振荡器振动档位scale#5,振动时间20秒;加入促凝集剂:collagen终浓度5ug/ml,fibrinogen终浓度0.2 mg/ml;将促凝集剂加入每孔中,振荡,避免产生气泡,酶标仪检测,记录OD值;计算结果:以Tyrode’s buffer的OD值为100%凝集率的阳性对照,以未加促凝集剂的血小板悬液为0%凝集率的阴性对照。根据excel算出凝集曲线公式。7.MTT法检测药物敏感性和细胞活性检测药物敏感性:铺板:收集处于对数生长期的待测细胞,离心去上清,将细胞重悬于含10%胎牛的完全培养基中,计数并调整细胞浓度为3×104/ml,在96孔板中接种100ul的细胞悬液（3×103个/孔）,将培养板放在培养箱预培养24h（在37℃C、5%CO2的条件下）;将ibrutinib稀释成不同浓度加入已铺好细胞的96空板中,100ul/孔,使得最终浓度分别为0^M,0.03 μM,0.1μM,0.3μM,1μM,3μM,每种浓度设立三个复孔,将培养板放在培养箱预培养3天（在37℃、5%CO2的条件下）;分别向每孔加入50ul 2mg/ml MTT溶液;将培养板放在培养箱内孵育3-4小时;培养板离心1500rpm5分钟,小心去掉上清;每孔加入200ul DMSO,并用移液枪吹打混匀,注意不要在空中生成气泡,否则会影响OD值的读数,如果产生了气泡,将培养板再次离心去除气泡;10分钟后,用酶标仪测定在570nm处的吸光度;计算细胞抑制率,细胞抑制率=[1-（药物孔OD/对照孔OD）]×100%。细胞抑制率>50%为敏感,30-50%为中度敏感,<30%为不敏感（耐药）。绘制细胞生长曲线。检测细胞活性:铺板:收集处于对数生长期的待测细胞,离心去上清,将细胞重悬于含10%胎牛的完全培养基中,计数并调整细胞浓度为3×104/rnl,在96孔板中接种100ul的细胞悬液（3×103个/孔）,将培养板放在培养箱预培养24h（在37℃C、5%C02的条件下）;将ibrutinib加入已铺好细胞的96孔板中,100ul/孔,使得终浓度为0μM或0.5μM。孵育细胞,在不同时间点:24h、48h、72h、96h,每个时间点每个浓度均设立三个复孔,分别向每孔加入50ul 2mg/ml MTT溶液;将培养板放在培养箱内孵育3-4小时;将培养板离心1500rpmm 5分钟,小心去掉上清;每孔加入200ul DMSO,并用移液枪吹打混匀,注意不要在空中生成气泡,否则会影响OD值的读数,如果产生了气泡,将培养板再次离心去除气泡;10分钟后,用酶标仪测定在570nm处的吸光度;计算细胞的增殖率,绘制细胞生长曲线。8.seahorse测定氧耗量利用Seahorse XFe 24代谢分析检测仪,检测ibrutinib处理前后细胞氧耗量的变化。仪器通过探针实时监测培养基中的氢离子浓度和氧气浓度,计算细胞的耗氧量。Seahorse检测方法快速、简便、精确,是目前肿瘤代谢检测的一种常规方法。提前一天预热探针板:将sehorse XF solution加入探针板中,1ml/孔,37℃孵育过夜;配胶,并调整胶的PH值后,加入XF的24 孔细胞培养板中;取对数生长的MEG-01细胞,加至六孔板中,设立对照组和ibrutinib组,用ibrutinib处理细胞60分钟;收集细胞,用新鲜培养基重悬并计数;将细胞悬液按照08*104/100ul/孔的浓度接种入XF细胞培养板中,并设定空白孔和复孔;离心,使悬浮的细胞沉入孔底;配药:oligomyxin终浓度为1 uM,FCCP终浓度为0.5 uM,rotenone终浓度为2 uM,将药物加入已孵育过夜的探针板中,37℃孵育30min;在细胞培养板每孔中加入新鲜培养基,使得总体积为525 ul,37℃孵育30min;将探针板放入seahorse仪器中校准,校准完成后,将细胞培养板放入一起种检测;待检测完毕,保存数据,并用软件进一步分析,绘制氧耗线图。9.流式细胞术分析ROS产生DCFDA是本身没有荧光、稳定存在的非极性的化学物质,可自由通透细胞膜。进入细胞后,被水解成DCFH,DCFH被胞内的氧化剂氧化成高荧光强度的DCF,用于检测ROS的生成。用ibrutinib处理血小板或MEG-01细胞后,加入DCFDA使其终浓度为1μM,37℃避光孵育20min;PBS洗涤一次,后加入新的PBS重悬血小板或细胞沉淀;上机检测。激发光488nm,先用阴性管上样,以FSC-SSC散点图设门,界定目标群,在F1通道下（488/530 nm）获取DCFDA信号。采用CellQest功能软件分析。10.实时荧光定量PCR检测mRNA水平用Trizol提取对数生长期细胞中总RNA,按实时荧光定量RT-PCR试剂盒说明进行实验。合成cDNA的反应条件为:37℃15分钟,85℃5秒。PCR的反应条件为:预变性95℃30秒,PCR反应95℃5s,60℃20s（40个循环）,溶解曲线分析95℃0秒,65℃15秒,95℃0秒。计算出2-△△Ct,代表每组mRNA的相对表达量。反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线,进行PCR定量时制作标准曲线。目的基因的表达量=2-△△Ct△△ct=（待测样品的目的基因的Ct的平均值一待测样本的看家基因的Ct的平均值）一（对照样品的目的基因的Ct的平均值一对照样本的看家基因的Ct的平均值）。11.Western blot检测蛋白表达处理后的细胞提取总蛋白,按照BCA法测定蛋白浓度,加入5×SDS-PAGE loading Buffer进行蛋白变性,然后经电泳、转膜,5%脱脂奶粉在37℃C封闭2h,TBST洗膜后用相应的一抗4℃孵育过夜,TBST洗膜后加入HRP标记的二抗孵育1h,洗膜后采用ECL法在显影仪上进行显影。12.分析miRNA表达谱首先,从染色体17p缺失和不伴有17p缺失的CLL病人的CLL细胞中提取RNA,同时从TCL1-Tg和TCL1-Tg:p53-/-鼠模型的脾细胞中提取RNA,操作步骤同第二章。其次,分析miRNA表达谱的变化,从每组中提取5 ug总RNA进行miRNA芯片分析。荧光定量PCR分析,从TCL1-Tg和TCL1-Tg:p53-/-鼠模型中分离1 X 107的脾细胞,提取总RNA,然后纯化定量。再进行逆转录（RT）和荧光定量PCR反应。逆转录反应:采用茎环法,按照PrimeScript RT reagent kit（TaKaRa,Dalian,China）说明书进行操作,所以操作均在冰上进行,待所有试剂加入后,然后在PCR仪上进行变性、退火反应。荧光定量PCR反应:以上述cDNA为模板,GAPDH为内参,检测各细胞中基因的mRNA水平,依据SYBRPremix Ex Taq Ⅱ（TaKaRa）试剂盒说明书进行操作。13.统计学分析所有结果均经SPSS16.0软件统计分析。数据以均数士标准差（x±s）表示,两样本均数的比较采用两独立样本的t检验（Independent-samples T test）。多组间的比较采用完全随机设计的方差分析（One-Way ANOVA）,进一步的多重比较采用LSD法（方差齐同时）或Dunnett’ST3法（方差不齐）。以P值<0.05为差异有统计学.意义。动物模型的生存曲线采用Kaplain-Meier分析。结果1、ibrutinib对于血小板数量和巨核细胞生长无显著影响（1）收集9例临床诊断为CLL的病人资料,分析服用ibrutinib前、后外周血.中血小板数量变化。除了1例病人在治疗后血小板数量明显下降,其余8例病人治疗后血小板计数只是轻微上升或者下降。（2）结合临床药物浓度,明确ibrutinib处理巨核细胞的最佳浓度为0.5 μM,将0.5 μM ibrutinib加入巨核细胞MEG-01中,连续培养1、2、3、4天,分别用MTT检测细胞生长情况。结果显示在每个时间点,ibrutinib处理组OD值与对照组OD值相比,均不存在显著性差异。表明该浓度ibrutinib不影响MEG-01细胞的生长。（3）从MEG-01细胞培养液中分离出血小板,加入荧光抗体PE mouse Anti-human CD41a,FITC mouse Anti-human CD49b 至血小板溶液中,使其与血小板表面标志性抗原结果,再通过流式细胞术检测荧光,确定血小板的生成。再用ibrutinib处理MEG-01细胞,分别于第1、3、5天从细胞培养基中分离出血小板进行计数。结果显示,在三个时间点,ibrutinib处理组的血小板生成数量与对照组相比,均无显著性差异。表明,ibrutinib对于巨核细胞MEG-01生成血小板的数量无影响。2、ibrutinib抑制胶原介导的血小板凝集ibrutinib分别处理临床标本30分钟,细胞标本1小时,加入5 μg/ml胶原诱发血小板凝集。通过酶标仪检测血小板的最大凝集率,从而分析ibrutinib对血小板的凝集功能是否存在影响。结果显示,无论在临床标本还是细胞标本,ibrutinib均导致血小板凝集功能的降低。3、ibrutinib刺激可抑制巨核细胞MEG-01的氧化代谢线粒体作为血小板中重要的细胞器,影响血小板的功能和存活。为进一步研究ibrutinib影响血小板凝集功能的机制,我们通过seahorse测量MEG-01细胞在ibrutinib处理后,其氧耗率的改变。结果显示,对照组在加入oligomycin后氧耗率显著下降,在加入FCCP后氧耗率明显上升。而在ibrutinib处理60分钟后,MEG-01细胞无论对于oligomycin还是FCCP的刺激,其耗氧率的改变均明显减小。这表明,ibrutinib抑制线粒体电子传递链,使得线粒体复合体活性降低。4、ibrutinib刺激可导致血小板和MEG-01细胞的ROS水平增加已知线粒体中电子传递链是ROS产生的主要场所和来源,并且之前研究发现在胶原诱导血小板激活的过程中,ROS作为内源性第二信号发挥着重要的作用。为探讨ROS是否参与ibrutinib引起的血小板凝集功能受损,我们用ibrutinib处理临床慢性淋巴细胞白血病病人的血小板样本、巨核细胞MEG-01分泌的血小板以及MEG-01细胞30-60分钟,通过流式细胞术检测ROS水平的变化。结果发现,无论是在血小板还是巨核细胞中,ibrutinib均能使ROS的产生增加。5、线粒体复合体Ⅰ抑制剂rotenone和线粒体复合体Ⅲ抑制剂antimycin对血小板的作用之前研究发现ibrutinib可抑制线粒体电子传递链,使复合体活性降低,因此我们进一步验证使用线粒体复合体抑制剂可否也影响对血小板的功能。Rotenone为复合体Ⅰ的抑制剂,antimycin为复合体Ⅲ的抑制剂。用0.5 uM rotenone和0.5 uM antimycin分别处理血小板,流式细胞术结果显示,无论在临床血小板样本中还是MEG-01分泌的血小板样本中,rotenone和antimycin均能增加ROS的产生。不仅如此,血小板凝集实验结果表明,rotenone和antimycin均能抑制血小板凝集,这与ibrutinib对血小板的影响相似。6、ibrutinib刺激对于线粒体呼吸链中OXPHOS复合体的基因和蛋白表达无影响ibrutinib抑制线粒体电子传递链,使得ROS生成增加,这是否是由ibrutinib抑制复合体的表达所引起的呢?为了验证这个问题,我们在ibrutinib刺激血小板和MEG-01细胞后,检测OXPHOS（oxidative phosphorylation）复合体的基因和蛋白表达变化。结果显示,无论在血小板还是MEG-01细胞中,ibrutinib刺激均不影响OXPHOS复合体的表达。这表明,ibrutinib刺激抑制线粒体复合体活性,不影响其表达。7、延长ibrutinib的刺激时间可抑制线粒体呼吸链中OXPHOS复合体Ⅰ的表达和ROS的生成之前的研究基于临床血小板标本体外存活约4-5小时,因此只给予了短时间的ibrutinib刺激（30-60 min）。但真实的临床情况并非如此,慢性淋巴细胞白血病病人服用ibrutinib 420mg/天,血小板和巨核细胞是长时间收到ibrutinib的刺激,因此我们利用体外培养的巨核细胞MEG-01和由其分泌的血小板,来研究长时间的ibrutinib刺激所产生的作用。（1）ROS检测:结果显示,ibrutinib处理MEG-01细胞和血小板第1天,ROS水平明显增加,但是在第3天,处理组的ROS水平下降到与对照组一致,第5天时,ibrutinib的长期刺激已使得ROS水平低于对照组。这表明,随着ibrutinib刺激时间的增加,ROS的生成是处于一个动态变化的过程。（2）OXPHO复合体表达变化的检测:我们在MEG-01细胞培养液中加入0.5 uM ibrutinib培养3天,再分别收集血小板和巨核细胞,提取RNA和蛋白,通过qPCR和western blotting检测分析发现,无论在MEG-01细胞中还是在血小板中,ibrutinib均能显著抑制complex Ⅰ的表达。这表明,ibrutinib的长期刺激不仅使得OXPHOS复合体Ⅰ活性进一步降低,更显著抑制复合体Ⅰ的表达。8、慢性淋巴细胞白血病病人长期服用ibrutinib后,血小板中OXPHOS复合体表达的变化收集9例慢性淋巴细胞白血病病人治疗前和治疗第28天的血液标本,分离出血小板,提取蛋白。通过WB分析,ibrutinib治疗前后,血小板中OXPHOS复合体表达的变化。结果显示,ibrutinib治疗前后,血小板中OXPHOS复合体表达的变化。结果显示,其中5例病人complex Ⅰ的表达显著降低,其余4例无明显变化。9、线粒体复合体对于syk通路的激活起着重要作用收集临床血小板标本,先给予0.5 uM ibrutinib刺激30分钟,之后加入5 ug/ml的胶原激活血小板10分钟。再提取血小板蛋白,通过WB分析发现,在血小板溶液中加入胶原,可显著增加syk的磷酸化,并且也使得一系列下游分子酪氨酸磷酸化增加,激活syk通路。但是,如果预先给予血小板ibrutinib刺激,会部分抑制胶原介导的激活作用,syk磷酸化减弱,下游分子酪氨酸磷酸化减少。这表明,ibrutinib可抑制胶原介导的酪氨酸磷酸化和syk通路的激活,这可能是导致血小板凝集功能障碍的原因之一。如果我们在血小板溶液中预先给予rotenone刺激,之后再加入胶原,WB结果分析显示,rotenone的作用与ibrutinib相似,可抑制胶原介导的酪氨酸磷酸化和syk通路的激活。这提示,ibrutinib可能是通过抑制线粒体呼吸链复合体,从而抑制酪氨酸磷酸化。我们再通过在MEG-01细胞培养液中加入适量过氧化氢,来模拟胶原激活血小板的情况。结果显示,过氧化氢可显著增加syk的磷酸化,并且也使得一系列下游分子酪氨酸磷酸化增加,激活syk通路。但是,如果预先给予MEG-01细胞ibrutinib刺激,会部分抑制过氧化氢介导的激活作用,syk磷酸化减弱,下游分子酪氨酸磷酸化减少。不仅如此,预先给予rotenone刺激,作用也与ibrutinib作用相似。10、TCL1-Tg:p53-/-鼠模型可发展为恶性程度高的CLL,具有发病早和生存期短的特点。为了制作p53缺失的CLL动物模型,我们将TCL1-Tg鼠与p53-/-鼠杂交,形成TCL1转基因且p53缺失的鼠（TCL1-Tg:p53-/-）。TCL1-Tg:p53-/-的鼠模型发病早,大概在3个月时就可以发展为CLL。并且大部分的老鼠（17/20）到4-5月出现严重的脾肿大。而TCL1-Tg鼠的脾脏大小相对正常（图3-1 A）。同时,4个月大的TCL1-Tg:P53-/-鼠的脾脏（n=5）明显重于相应年龄的TCL1-Tg鼠脾脏（n=5）（图 3-1 B,P<0.01）。同时,血涂片结果显示,TCL1-Tg:p53-/-鼠中,白细胞数量明显增加（图3-1 C）。并且,生存分析结果表明,大部分的TCL1-Tg:p53-/-鼠在3-5个月即死亡,而大部分的TCL1-Tg鼠存活时间大于12个月（图3-1 D）。TCL1-Tg和TCL1-Tg:p53-/-鼠的生存时间存在显著性差异。TCL1-Tg:p53-/-鼠的中位生存时间是3.8个月,TCL1-Tg鼠的中位生存时间是19个月。11、CLL细胞中p53的缺失可下调miR-15a和miR-16-1的表达利用CLL的动物模型和临床标本检测,p53缺失后miRNA的表达谱变化。我们首先从TCL1-Tg和TCL1-Tg:p53-/-鼠模型中分离出脾细胞,再从脾脏细胞中提取总RNA,利用miRNA芯片检测差异表达的miRNA。在300多个芯片分析的miRNA中,我们发现与TCL1-Tg鼠相比,miR-15a和miR-16-1在TCL1-Tg:p53-/-鼠中的表达呈显著下降。不仅在脾脏细胞,对腹腔细胞的检测也得出一致的结果。同时,通过收集CLL病人临床血液标本,我们分析染色体17p缺失和不伴有17p缺失的CLL细胞,发现miR-15a和miR-16-1的表达在17p缺失时也呈现明显的抑制,也动物模型中的表达变化一致。以上数据表明,p53的缺失可引起miRNA表达的显著改变结论1、ibrutinib治疗慢性细胞白血病时对血小板数量无显著影响,但可引起胶原介导的血小板凝集功能障碍。2、ibrutinib处理可抑制血小板线粒体呼吸链的活性,导致血小板凝血功能障碍。3、ibrutinib处理可造成ROS水平降低,抑制氧化磷酸化复合体OXPHOS的表达。4、syk通路的激活为胶原介导的血小板凝集所必需,线粒体呼吸链的活性的降低可抑制syk通路的激活。5、TCL1-Tg:p53-/-老鼠模型可模拟人类染色体17p缺失的CLL,具有发病早、生存期短的特点。6、染色体17p缺失引起miRNA表达谱变化。综上所述,本课题的研究结果表明ibrutinib对于血小板数量和巨核细胞的生长无显著影响,但可以通过抑制线粒体呼吸链和syk通路的激活从而影响血小板凝集,这也可能是ibrutinib造成出血事件的主要机制。同时建立TCL1-Tg:p53-/-动物模型,发现染色体17p缺失、p53功能的异常可引起miRNA表达谱的显著改变。通过本项目研究,明确ibrutinib引起血小板凝集功能障碍的分子机制,为预防出血副反应提供靶点。同时进一步探讨染色体17p缺失CLL的发生发展机制。