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目的： 检测基因工程表达生产的降血压肽Val-Leu-Pro-Val-Pro(VLPVP)的降血压活性,建立其高效液相色谱(HPLC)检测方法,并对其吸收机理进行研究,为其进入实际应用提供理论基础。 方法： 1) ACE能催化HHL分解产生马尿酸,而降血压肽通过抑制ACE的活性降低马尿酸的产量,采用反向HPLC测定马尿酸在228 nm处的吸收,以此计算目的多肽体外活性; 2)通过测量口服降血压肽后SHR老鼠血压的变化确定VLPVP的体内降血压活性; 3)利用安捷伦1100液相色谱仪和VYDAC238EV54 C18反向色谱柱确定降血压肽VLPVP的液相检测方法; 4)采用MTT比色法研究VLPVP对Caco-2细胞的毒性; 5)通过观察Caco-2细胞单分子层的形态,细胞极性研究、标志物渗漏检测和跨膜电阻(TEER)来判断模型是否成功建立; 6)采用Caco-2细胞模型来研究VLPVP的细胞吸收转运动力学。考察了pH、浓度、ATP能量抑制剂、竞争性转运载体抑制剂、表面活性剂、P-gp抑制剂、MRP1和MRP2抑制剂以及细胞内吞抑制剂等对VLPVP的转运吸收和分泌的影响。 结果： 1)建立HPLC法测定VLPVP的色谱条件如下,色谱柱:VYDAC238EV54 C18(200 mm×4.6 mm,5μm);流动相:乙腈:水(22:78),0.05％TFA;流速:1.0 mL/min;检测波长:202nm;柱温:30℃;灵敏度:0.01AUFS;进样量:20μL。日内、日间精密度RSD%均在2%以下,准确度均在99%以上。VLPVP在室温以下及6.0-8.0的pH下贮存相对稳定,可贮存30d。反复冻融3次对其稳定性无影响。 2)研究了降血压肽VLPVP的体内体外降血压活性,其体外对血管紧张素转化酶的抑制活性(IC50)为1.8μM。 3)以800μg/kg·bw剂量口服给药高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat)2 h后,降压幅度达到40.9±15.7mmHg,与空白对照组比较血压降低显著(P<0.01),以400μg/kg·bw剂量口服给药高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat)2 h后,降压幅度达到28.3±23.0mmHg与空白对照组比较血压降低显著(P<0.05),较卡托普利对照组(10mg/kg·bw)相当,其降血压活性可以持续12h以上,而且对正常大鼠的血压无显著的降血压作用。 4)采用MTT比色法研究VLPVP对Caco-2细胞的毒性。实验结果表明,小于14 mmo/L的VLPVP溶液对细胞没有毒性;而大于14mmo/L的VLPVP溶液对细胞呈现毒性。 5)在本实验室的培养条件下,经过21d培养分化后,Caco-2细胞分化形成了具有细胞极性的单分子层结构,符合VLPVP转运实验的要求,因而可以作为考察VLPVP小肠吸收转运的体外实验模型。 6)采用体外Caco-2细胞模型研究VLPVP的细胞吸收转运机制,结果表明VLPVP在Caco-2细胞的转运主要是通过被动扩散和MRP2介导的主动转运。 结论： 通过基因工程表达的VLPVP有着较强的体内体外降血压活性,其转运方式以旁路转运为主要方式被小肠上皮细胞吸收,并受到多药耐药蛋白MRP2强烈的外排作用。