蜘蛛是世界上物种数目最丰富的动物类群之一,视觉系统高度多样化,但我们对这些视觉系统遗传基础的了解依然很少。小弱蛛属(Leptonetela)是弱蛛科(Leptonetidae)的第一大属,目前全世界已经描述了108个种,分布于中国、越南、土耳其、格鲁吉亚、阿塞拜疆和希腊。它是一种小型的简单生殖器类蜘蛛,具有独特的六眼模式,后中眼与强烈弯曲的前侧眼和后侧眼分离,绝大部分种群栖息于洞穴中,眼睛退化成4只、2只甚至完全消失。洞穴动物进化出了一系列洞穴适应性性状,包括眼睛和色素的退化或丢失。对于科学家和公众而言,眼睛退化和视觉丢失是最为引人注目的特征,理解其遗传机制长期以来是进化生物学的挑战。因此,探讨小弱蛛视觉系统遗传基础对于揭示蜘蛛视觉系统乃至洞穴生物眼睛退化机制具有极其重要的意义。贵州省地处中国南方,以典型的喀斯特地貌闻名于世,具有发育良好,分布广泛的喀斯特洞穴。贵州洞穴中生活着丰富的洞穴生物,比如全世界最丰富的小弱蛛种群。我们在贵州省绥阳县、福泉市和贵定县的五个洞穴中采集到了网胸小弱蛛L.reticulopecta Lin&Li,2010、四刺小弱蛛L.tetracantha Lin&Li,2010和一个小弱蛛新种L.sp1。网胸小弱蛛麻黄洞和山王洞种群栖息于洞穴入口,六眼完整,蛮王洞种群栖息于洞穴深处,六眼退化成白色眼点。四刺小弱蛛羊子洞和翁水大洞种群均栖息于洞穴深处,前者眼睛退化四个紧凑的细小白点,而后者眼睛完全退化。同时,小弱蛛新种栖息于蛮王洞入口,六眼保持完整。这些表型多样的材料是我们良好的研究对象。本研究的主要目的包含以下三个方面:(1)利用转录组测序技术探索三种小弱蛛的遗传信息:(2)恢复小弱蛛视觉相关基因,了解洞穴蜘蛛视觉相关基因的表达情况;(3)初步探讨洞穴蜘蛛眼睛退化的遗传差异,为进一步研究其退化机制奠定基础。本文的研究分为两部分:(1)基于转录组学的小弱蛛生物信息学分析及眼睛退化机制的初步探索:(2)利用转录组测序数据恢复小弱蛛视觉相关基因。主要实验结果有:(1)蛮王洞L.sp1、L.reticulopecta和翁水大洞L.tetracantha具有不同的眼睛表型,我们利用Illumina Hiseq测序平台对三种小弱蛛多个个体头胸部形成的混合样本进行测序。L.sp1,L.reticulopecta和L.tetracanth组装分别获得27564、32350和35454条Unigene,各有16573、19275、21488条Unigene在数据库中获得注释。比较分析发现三者基因的整体表达模式相似,支持了形态学上的亲缘关系。(2)蛮王洞六眼完整的L.sp1和六眼退化成六个白色眼点的L.reticulopecta样本合并组装,获得43642条Unigene,其中有23089条Unigene获得注释。样本中发现了1408个差异表达基因(differently expressed genes,DEGs),678个基因获得注释。198个DEGs注释到GO数据库中,其中催化活性、结合、代谢过程和细胞过程富集最显著。179个DEGs注释到COG数据库的19个功能分类中,通用功能、能量生产与转化、氨基酸转运与代谢注释基因最多。235个DEGs注释到KEGG数据库中,氧化磷酸化、视黄醛代谢、细胞外基质受体相互作用和药物代谢-细胞色素P450富集最显著。在小弱蛛新种和网胸小弱蛛中,表皮结构成分structural constituent of cuticle富集可能与洞穴蜘蛛表皮变化有关,但两种蜘蛛的生理节律circadian rhythm却没有差异,而富集分析表明两者代谢方面存在较大差异。同时,我们发现了glass、ninac、Omega-crystallin、Kynurenine formamidase、dihydropteridine reductase、Protein Kinase C、RNA-binding protein lark、6-pyruvoyl tetrahydrobiopterin synthase等8个光相关基因差异表达,这可能与两者的视觉系统差异有关,但也有可能只是头胸部整体表达情况。(3)L.reticulopecta和L.tetracantha均具有两种不同眼睛形态的种群,我们在两种小弱蛛单个个体头胸部转录组中筛查光感受器分化、视网膜基因决定网络、晶状体蛋白、无脊椎动物视网膜通路和光传导通路等五类视觉相关基因。采用八个样本的转录本数据,我们在L.reticulopecta和L.tetracantha中确定了四类基因中的所有基因家族,只有视网膜基因决定网络中的eya未检测到,表明经典视觉相关基因也可能在小弱蛛眼睛中表达。在眼睛退化的样本中,绝大部分基因的表达并没有明显差异,表明洞穴黑暗环境并不会明显影响绝大部分视觉相关基因的表达,暗示眼睛退化的小弱蛛可能仍具有一定的视觉功能。本论文只包含研究的初步结果,本实验室正在进行后续相关数据分析。