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南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarfvirus,SRBSDV)或水稻黑条矮缩病毒2(Rice black-streaked dwarfvirus2,RBSDV-2)是一种新病毒,分类上属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus),近年来已在我国和越南等地流行,给当地的水稻和玉米生产造成严重损失。水稻和玉米病株的典型症状包括植株显著矮缩、叶色深绿、沿茎或叶脉产生瘤状凸起。和SRBSDV相似,大部分植物呼肠孤病毒(包括斐济病毒属病毒、稻属病毒、植物呼肠孤病毒属病毒)都引起宿主植物产生瘤状结构。但迄今,这些症状的产生机制,尤其是瘤的发生机制,仍然一无所知。本研究以SRBSDV在水稻植株上诱导形成的瘤为模式并运用显微学、分子生物学、反向遗传学等技术手段来分析植物病毒诱导致瘤的机制和瘤状结构特征。组织化学染色和显微观测显示SRBSDV诱导形成的瘤源于植物韧皮部的增生,增生部分明显包含2个区域,一个是富含细胞质区,另一个是缺乏细胞质区。定量分析显示,瘤状组织富含病毒蛋白和病毒RNAs,表明瘤是用于SRBSDV病毒复制增殖和积累的场所;瘤状结构中含有大量的病毒基质(viroplasms)、晶状排列的病毒以及含有病毒粒子的管状结构,进一步支持瘤是该病毒增殖和积累场所的结论,表明瘤在SRBSDV侵染循环中有着重要功能。对SRBSDV诱导的瘤和健株韧皮部超微结构的比较阐明了瘤中异常的发育模式。从组织方式看,瘤中富含细胞质区域主要由韧皮部薄壁细胞(PP)聚集形成,缺乏细胞质区域则由筛管细胞(SE)组成,明显缺乏伴胞(CC);而健康植株的韧皮部则总是呈现经典的筛管(SE)-伴胞(CC)伴生组织模式,表明瘤状结构的细胞组织形式打破了传统的SE-CC模式。从形态上看,健株SE细胞定向伸长生长且细胞的长短轴比超过30;而瘤中SE细胞呈无定向生长且长短轴之比不超过3,表明瘤中SE发育异常。从细胞功能来看,瘤中PP和SE细胞均含有大量的病毒蛋白、核酸、病毒粒子,表明瘤中SE和PP均能够支持病毒的复制增殖和积累。因此,这些结构功能改变的SE为SRBSDV增殖提供广阔的空间,表明瘤的形成有利于病毒的增殖循环。为了研究瘤在病毒侵染循环中的功能以及SRBSDV这类粒子直径约80 nm的病毒在植物体内的运动,我们还重点分析了瘤中细胞间通道。有意义的是,我们在瘤中发现了一种新的细胞间通道,这种通道在健株中很少,却大量存在于瘤中的SE-SE或SE-PP界面上。该通道结构特征上与胞间连丝(PD)更相似,具有与PD连丝微管(DT)类似的髓样结构,也由actin组成,但其容纳能力则与筛孔相似,能够容纳直径约80 nm的病毒粒子,比PD容纳能力(约30 nm)则大得多。胶体金标记实验表明该通道能造成周边细胞壁成份改变,包括纤维素减少和胼胝质增加。根据该新通道的特性,我们将其暂命名为Flexible gateway(FL通道)。瘤中,FL通道发生频率显著增加,分布更分散,利于SE-SE或SE-PP之间的共质体运输。显微观察表明,PD通道无法包含尺寸较大的SRBSDV粒子,却在SE-SE、SE-PP之间的FL通道内观察到完整的SRBSDV粒子,这为FL通道参与病毒的运动提供了直接证据。进一步对其它植物呼肠孤病毒侵染的病株进行超微结构分析发现,水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)、水稻瘤矮病毒(RGDV)、水稻齿叶矮缩病毒(RRSV)等植物韧皮部限制性病毒均引起病株韧皮部细胞增生,增生区域的细胞类型、细胞组织模式、FL通道数量均与SRBSDV诱导的瘤相似;相比之下,非韧皮部限制性的植物呼肠孤病毒——水稻矮缩病毒(RDV)侵染的病株韧皮部则与健株对照相似。基于这些研究结果,我们提出了一个行之有效的模型来解释瘤在韧皮部限制性植物呼肠孤病毒侵染循环过程中的功能及FL通道促进植物呼肠孤病毒在植物体内运动的方式。为了进一步了解瘤的形成机制,我们在构建水稻和SRBSDV cDNA文库的基础上,采用酵母双杂交技术发现SRBSDV P1能与一个水稻细胞周期因子——成视网膜瘤蛋白(OsRBR1)在酵母中相互作用,随后双分子互补荧光(BiFC)和pull down实验一致性地表明二者在体内外均存在强烈的相互作用。缺失突变分析显示P1C-端部分和OsRBR1的A/B结构域在二者互作过程起关键作用。免疫胶体金标记实验也表明在病株水稻体内二者共定位于病毒内含体中,表明二者互作改变了 OsRBR1的亚细胞定位和分布。在本氏烟叶片中瞬时表达SRBSDV P1蛋白能显著干扰RBR-E2F之间的相互作用;利用重组病毒载体系统在植物体内表达SRBSDV P1不仅显著影响RBR-E2F信号传导途径相关基因的表达,而且引起维管束细胞增生,在叶脉上形成瘤状突起;但不与RBR蛋白互作的P1突变体在植物体内表达则与对照相似。转基因持续表达P1于SRBSDV自然寄主水稻能也能引起维管束细胞增生。另外P1过表达还能引起维管束中SE相关的胞壁通道出现频率(包括PPU和flexible gateway)相比阴性对照显著增加;而不与RBR蛋白互作的P1突变体表达于烟草,上述SE相关胞壁通道出现频率恢复到与阴性对照相似。这些结果表明SRBSDV P1蛋白是一个植物病毒致瘤基因,它通过与植物RBR相互作用,改变RBR的亚细胞定位和分布,干扰RBR-E2F的互作并影响其信号传导途径相关基因的表达,从而改变细胞周期诱发细胞增生产生瘤突,并诱导SE中胞壁通道出现频率增加,以及导致细胞定向伸长能力的消失。总之,本研究揭示了瘤的结构特征,发现一种新的细胞间通道,获得了其参与植物呼肠孤病毒运输的证据,同时鉴定了 SRBSDV致瘤基因及其通过与RBR互作诱发细胞增生的机制。这些研究结果将有助于深入理解植物病毒运动及致瘤机理,另外增加我们对RBR-E2F途径本身的了解。