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大量研究证实脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后脑源性神经营养因子(Brain Derived Neurotrophic Factor,BDNF)可以通过多种机制发挥其神经保护作用,进而抑制神经元的凋亡,促进轴突再生,调节突触传递,增强神经兴奋性,促进前体细胞的增殖和髓鞘再生。尽管有研究显示BDNF具有抗炎抗氧化作用,并且对免疫反应具有一定的调节作用,但SCI后BDNF对炎症反应的影响尚不明确。本课题通过系列研究证实SCI后损伤局部过表达BDNF可以明显改善炎症微环境,抑制促炎因子(IL-1β,TNF-a)的表达并上调抑炎因子(IL-10,IL-13)的表达,同时可以促进损伤区巨噬细胞/小胶质细胞表型由M1向M2转变。此外,BDNF对炎症反应的调解在一定程度上增强了其神经保护作用并显著促进了运动功能的恢复。第一部分:SCI后损伤中心处注射Lenti-BDNF载体成功过表达并以转染损伤局部炎症细胞为主材料与方法1.Lenti-BDNF载体构建;BDNF基因片段经PCR扩增,将扩增的BDNF基因片段交换入线性化GV208表达载体,获得GV208-BDNF慢病毒过表达质粒并转化感受态细胞。阳性克隆菌落行PCR鉴定,对重组质粒进行测序后将其与慢病毒包装系统共同转染293T细胞进行病毒包装,最后通过Real-time PCR法进行病毒滴度检测。2.C57BL/6脊髓损伤模型建立;通过建立两种常用SCI动物模型,T10节段背侧半切模型和T10节段动脉夹夹伤模型。选择适合于本课题慢病毒载体注射的SCI模型。3.损伤中心处Lenti-EGFP和Lenti-BDNF注射以及转染细胞种类的鉴定;通过立体定向仪以及汉密尔顿微量进样器向损伤中心处注射慢病毒载体,通过对损伤节段进行CD11b和GFAP免疫荧光染色,明确慢病毒转染细胞种类。4.各组损伤节段BDNF表达水平检测;慢病毒载体注射后第4天,通过ELISA检测各组损伤节段(自损伤中心处向头侧和尾侧各1.5mm)BDNF的表达水平。结果1.GV208-BDNF过表达质粒的阳性克隆鉴定显示测序结果与目标序列比对完全一致。慢病毒包装后Real time PCR法测定病毒滴度为2.00E+8TU/ml。2.T10节段背侧半切模型和动脉夹夹伤模型都可以破坏小鼠的皮质脊髓束(CST)并造成后肢运动功能的丧失,但夹伤模型能够更好的保护硬脊膜,减少病毒流失,更适合本课题研究。3.慢病毒注射后4天(脊髓损伤后第7天),共聚焦结果显示EGFP细胞广泛分布在损伤中心处,并且在转染EGFP的细胞中,CD11b阳性细胞的百分比分在lenti-EGFP和Lenti-BDNF组中均达到了80%以上,说明在损伤中心灶注射的慢病毒载体主要转染的细胞为损伤局部的炎症细胞。4.通过ELISA对损伤节段处BDNF的总体表达水平检测显示lenti-BDNF组(62.63±8.74 ng/g)的表达水平明显高于lenti-EGFP组(0.59±0.15 ng/g)以及saline组(0.68±0.13 ng/g)(P<0.001)。结论1.Lenti-BDNF慢病毒包装成功,病毒滴度较高,能够满足实验需要。2.改良动脉夹夹伤模型能够更好的保护硬脊膜完整,更适合损伤局部慢病毒注射。3.损伤中心处注射的慢病毒载体主要转染的细胞为损伤局部的炎症细胞。此种注射方法有利于对BDNF在免疫炎症调节中的作用进行研究。4.通过ELISA定量检测证实,Lenti-BDNF载体在损伤节段成功过表达。第二部分SCI后损伤处过表达BDNF在免疫炎症调节和神经保护中具有显著作用第一节:损伤中心处过表达BDNF可以促进巨噬细胞表型由M1向M2转变并对炎症微环境具有明显的调节作用材料与方法1.实验对象;成年雌性C57BL/6小鼠跟据注射载体的不同分为:Lenti-EGFP组,Lenti-BDNF组和Saline组(于损伤中心处注射生理盐水)以及Sham组(仅进行椎板切除,不对脊髓造成损伤)。2.通过免疫荧光对巨噬细胞表型进行检测;对各组损伤组织切片进行CD16/32(M1标记物)和Arginase-1(M2标记物)免疫荧光标记,检测各组巨噬细胞表型的变化。3.通过流式细胞学进行M1/M2表型检测分析;对损伤节段进行取材(损伤中心至头侧和尾侧各1.5mm),消化,洗涤,过滤后获得单细胞悬液,然后予以M1表型(CD16/32,i NOS,)和M2表型(arginase-1,CD206)流式抗体孵育及检测。4.炎症因子的表达水平检测;对各组损伤节段促炎因子(TNF-a,IL-1β)和抑炎因子(IL-10,IL-13)的表达水平进行ELISA检测。5.在体外培养骨髓来源巨噬细胞(BMDM)过程中进行BDNF刺激,并通过q RT-PCR检测炎症因子的表达水平以及通过Western Blot检测arginase-1和i NOS的蛋白表达水平,以明确BDNF是否可以直接作用于对巨噬并对其表型产生影响。结果1.共聚焦结果显示脊髓损伤后lenti-BDNF组arginase-1阳性细胞数相比lenti-EGFP组和saline组明显增多(P<0.05),而lenti-BDNF组CD16/32阳性细胞数比lenti-EGFP组和saline组明显减少(P<0.05)。此外,与Lenti-EGFP组相比Lenti-BDNF组中未与EGFP共定位的Arginase-1+细胞百分比明显升高,同时未与EGFP共定位的CD16/32+细胞百分比显著降低(P<0.05)。2.流式结果分析显示,与lenti-EGFP组和saline组相比,lenti-BDNF组中与M1表型相关的CD16/32和i NOS阳性细胞百分比明显下降,而与M2表型相关的arginase-1和CD206阳性细胞百分比显著上升。3.ELISA检测结果显示损伤局部过表达BDNF可以明显降低促炎因子IL-1β和TNF-α的表达,同时显著上调抑炎因子IL-10和IL-13的表达。4.在体外试验中,q RT-PCR检测经BDNF刺激的BMDM的炎症因子的表达与对照组无明显差异,Western Blot检测表型相关蛋白arginase-1和i NOS的表达与对照组亦无显著差异。结论1.SCI后损伤中心处过表达BDNF可以促进巨噬细胞由M1向M2表型转变,并且初步分析显示,损伤处巨噬细胞极性的转变可能并非通过BDNF直接作用于巨噬细胞引起的。2.过表达BDNF可以抑制促炎因子的表达并上调抑炎因子的表达水平,在改善炎症微环境中具有一定的作用。3.体外重组BDNF刺激BMDM后,并未引起巨噬细胞表型的改变,表明重组BDNF不能直接作用于巨噬细胞。第二节:损伤中心处过表达BDNF可以促进SCI后的神经损伤修复材料和方法1.运动功能评估;通过旷场试验对Lenti-EGFP和Lenti-BDNF两组小鼠的行为学予以Basso Mouse Scale(BMS)评分,以评价BDNF对SCI后运动功能恢复的影响。2.脱髓鞘检测;通过对Lenti-EGFP和Lenti-BDNF组脊髓损伤节段矢状位切片进行Luxol Fast Blue(LFB)染色,以评估BDNF对髓鞘的保护作用。3.BDA(Biotinylated dextran amine)示踪;脊髓损伤后14天向小鼠运动皮层予以BDA注射,对损伤后的皮质脊髓束(CST)进行示踪,观察BDNF对CST轴突回缩的影响。4.对损伤局部神经纤维的影响;通过对Lenti-EGFP和Lenti-BDNF损伤节段进行NF-200免疫荧光染色,观察BDNF对损伤局部神经纤维的影响。结果1.通过对两组小鼠损伤后1,3,7,14,28天进行BMS评分显示,亚急性期Lenti-BDNF组的小鼠运动功能恢复较Lenti-EGFP组明显提高。2.LFB染色结果显示Lenti-BDNF组脱髓鞘程度较Lenti-EGFP组明显减轻。3.结果显示Lenti-BDNF组CST轴突末端距离损伤边缘较Lenti-EGFP组明显缩短,表明过表达BDNF可以显著减少CST的轴突回缩。4.NF-200免疫荧光染色结果显示损伤中心处过表达BDNF可以明显抑制神经纤维的崩解,具有明显的神经保护作用。结论SCI后损伤局部过表达BDNF能显著促进神经损伤修复,具有明显的神经保护作用。但需要注意的是:损伤中心处注射慢病毒载体以转染损伤局部炎症细胞为主,而并非损伤周围的神经元、轴突、少突胶质细胞等。所以本研究中BDNF对免疫炎症反应的调节作用在神经保护中可能起了重要的作用。