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阿尔茨海默病(Alzheimer Disease,AD)是一种与年龄密切相关的神经退行性疾病,起病隐匿,病情迁延渐进,给家庭和社会带来沉重的经济及心理负担。研究发现AD患者早期即可出现明显的昼夜节律紊乱,而昼夜节律紊乱又可加重AD的其他症状,如学习记忆及认知功能障碍等。目前已证实AD的核心病理变化之一,脑内神经元间隙异常沉积的β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein,Aβ)是AD患者昼夜节律紊乱的病理基础。本课题组前期研究也发现Aβ的核心毒性片段Aβ31-35可导致小鼠跑轮节律紊乱及海马神经细胞生物钟基因表达异常,然而Aβ31-35诱导昼夜节律紊乱的机制尚未完全阐明。自噬作为溶酶体介导的细胞自我处理系统,与清除细胞内异常积聚蛋白密切相关。近年来,自噬流作为一个新的概念已被广大学者所关注,它包含整个自噬过程,包括自噬小体的形成、自噬小体与溶酶体融合及自噬溶酶体底物的降解和大分子物质释放回细胞质的整个流程,其中自噬小体与溶酶体顺利融合对维持自噬流通畅至关重要,若二者融合障碍则可导致自噬流受阻。越来越多的证据表明自噬与昼夜节律之间的关系密不可分,有学者发现自噬可以调控肝脏组织核心生物钟基因Cry1表达水平,高糖诱导肝脏组织自噬流受阻可导致CRY1蛋白异常累积进而导致节律紊乱,这在一定程度上提示自噬流通畅对维持昼夜节律震荡体系正常运转至关重要。诸多研究表明,自噬与AD病情的发生发展关系密切,无论是AD动物模型还是AD患者,其脑组织自噬流均存在不同程度受阻。然而,自噬流受阻是否参与Aβ31-35诱导的昼夜节律紊乱目前尚不清楚。本研究采用C57BL/6小鼠及小鼠海马HT22神经细胞作为研究对象,通过跑轮行为学实验、Real time-PCR及Western Blot实验证实Aβ31-35可导致小鼠跑轮节律紊乱及海马神经细胞生物钟基因Per2及Bmal1异常表达;且Aβ31-35可诱导HT22神经细胞自噬流明显受阻;采用CCK8实验证实Aβ31-35对HT22神经细胞具有明显神经毒性作用,可导致细胞存活率显著降低;利用雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)及3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)上调或抑制细胞自噬水平,结果发现Rapa明显逆转Aβ31-35所致HT22神经细胞自噬流受阻,同时显著缓解Aβ31-35诱导的生物钟基因异常表达和细胞存活率降低,3-MA抑制自噬后可加剧Aβ31-35诱导的生物钟基因异常表达以及其细胞毒性作用;进一步在动物水平采用Rapa上调自噬,结果发现小鼠跑轮节律得到明显恢复且海马生物钟基因异常表达得到改善。由此我们认为自噬流受阻参与Aβ31-35诱导的昼夜节律紊乱,这也从自噬角度为AD患者昼夜节律紊乱提供潜在的治疗靶点。第一部分Aβ31-35诱导小鼠昼夜节律紊乱和海马生物钟基因Per2、Bmal1异常表达目的:明确Aβ31-35可扰乱C57BL/6小鼠跑轮节律并且诱导小鼠海马组织及HT22神经细胞生物钟基因Per2和Bmal1表达异常。方法:选取6-8周雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组及Aβ31-35组,通过跑轮行为学实验检测小鼠自由运转周期、平均每天活动量、节律性鲁棒值的变化,跑轮结束后按时间点取下各组小鼠海马组织,采用Real-time PCR及Western Blot实验检测海马组织内生物钟基因Per2和Bmal1 m RNA及蛋白表达变化情况。培养小鼠海马HT22神经细胞分为对照组和Aβ31-35处理组,利用Real-time PCR及Western Blot实验检测海马HT22神经细胞生物钟基因Per2和Bmal1 m RNA及蛋白表达变化情况。结果:(1)海马内注射Aβ31-35诱导C57BL/6小鼠跑轮节律紊乱。(2)Aβ31-35导致C57BL/6小鼠海马组织生物钟基因Per2和Bmal1表达异常。(3)Aβ31-35诱导小鼠海马HT22神经细胞生物钟基因Per2和Bmal1表达异常。结论:Aβ31-35可以引起C57BL/6小鼠跑轮节律紊乱及海马神经细胞生物钟基因Per2和Bmal1表达异常。第二部分Aβ31-35诱导小鼠海马HT22神经细胞自噬流受阻目的:探讨Aβ核心毒性片段Aβ31-35对小鼠海马HT22神经细胞自噬流的影响及其可能机制。方法:选取小鼠海马HT22神经细胞分为对照组和Aβ31-35处理组,采用Real-time PCR和Western Blot实验方法检测自噬相关基因LC3、Beclin1 m RNA和蛋白在CT4、CT8、CT12、CT16、CT20、CT24时间点的变化情况。同时采用Western Blot检测自噬底物P62蛋白及溶酶体膜相关蛋白(LAMP1)在上述各个CT时间点变化情况。进一步利用氯喹预处理HT22细胞抑制自噬小体和溶酶体融合,再次检测自噬相关蛋白LC3、BECLIN1、P62蛋白变化情况。结果:(1)Aβ31-35诱导小鼠海马HT22神经细胞自噬流受阻。(2)Aβ31-35导致HT22神经细胞LAMP1表达水平降低。结论:Aβ31-35诱导小鼠海马HT22神经细胞自噬流受阻,且Aβ31-35介导的溶酶体功能障碍可能参与Aβ31-35诱导的HT22神经细胞自噬流受阻。第三部分自噬流受阻参与Aβ31-35诱导的昼夜节律紊乱目的:探讨Aβ31-35诱导的自噬流受阻是否参与其诱导的昼夜节律紊乱。方法:选用小鼠海马HT22神经细胞,分为对照组、Aβ31-35组、Rapa+Aβ31-35组、3-MA+Aβ31-35、Rapa单独处理组,采用Real-time PCR、Western Blot实验方法检测各组HT22细胞在不同CT时间点生物钟基因Per2、Bmal1 m RNA和蛋白表达情况,采用CCK8细胞毒性实验检测各组细胞存活率。选用6-8周C57BL/6小鼠随机分为对照组、Aβ31-35组、Rapa+Aβ31-35组、Rapa组,采用跑轮行为学实验观察各组小鼠的跑轮节律改变情况,并检测各组小鼠跑轮结束后海马组织内生物钟基因Per2、Bmal1 m RNA和蛋白的表达情况。结果:(1)Rapa部分恢复Aβ31-35诱导的小鼠海马HT22神经细胞自噬流受阻。(2)Rapa有效逆转Aβ31-35所致HT22细胞生物钟基因Per2和Bmal1表达异常并部分逆转Aβ31-35所致小鼠海马HT22神经细胞存活率下降。(3)3-MA进一步抑制海马HT22神经细胞自噬水平。(4)3-MA加剧Aβ31-35诱导的海马HT22神经细胞生物钟基因Per2和Bmal1表达异常并进一步加重Aβ31-35所致海马HT22神经细胞存活率下降。(5)Rapa部分恢复Aβ31-35所致小鼠跑轮节律紊乱。(6)Rapa部分拮抗Aβ31-35所致小鼠海马组织生物钟基因Per2和Bmal1异常表达。结论:自噬流受阻参与Aβ31-35诱导的昼夜节律紊乱。