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目的:诺卡菌病是由诺卡菌引起的感染性疾病,其感染人群随着器官移植、艾滋病等各类免疫功能低下患者数量的增加而逐渐增多。然而,由于诺卡菌结构的复杂性,并缺乏有效的遗传操作手段,导致诺卡菌致病机制和毒力因子的研究鲜有报道。直至2004年第一株诺卡菌(鼻疽诺卡菌)的全基因组测序完成,为人们研究诺卡菌致病机制带来新的视角和方法。本研究结合基因组和蛋白质组技术,对临床分离的萜烯诺卡菌NT001株和NT002株进行分析,探究萜烯诺卡菌的毒力因子,为进一步研究诺卡菌的致病机制提供前期依据和方向。方法:1.通过临床微生物学常规培养,分离得到萜烯诺卡菌NT001株和NT002株;根据16s rRNA测序进一步确定诺卡菌的分类,并构建诺卡菌的系统进化树;参考美国临床试验标准委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)的M24A实验方案,对诺卡菌NT001株和NT002株进行常规抗菌药物敏感性试验,了解NT001株和NT002株的抗菌药物特征谱;采用干重法测定NT001株和NT002株的的生长特性;2.利用Illumina和PacBio双测序平台,获得NT001株和NT002株的全基因组数据,并应用HGAP软件和bowtie2软件完成序列拼接和修正。将基因组序列分别与基因本体论(Gene Ontology,GO)和直系同源家族蛋白聚类(Cluster of Orthologous Group of proteins,COG)数据库进行比对,完成GO和COG功能注释;应用BLASTP将NT001株与NT002株基因组与毒力因子数据库(Virulence Factors Database,VFDB)和抗生素耐药基因数据库(Antibiotic Resistance Genes Database,ARDB)进行比对,发掘NT001株和NT002株基因组的毒力因子和耐药基因;应用PSORTb软件和IslandViewer软件,分别完成基因岛和编码蛋白亚细胞定位的分析;3.应用串联质谱标记(Tandem Mass Tag,TMT)定量蛋白质组技术,完成NT001株和NT002株的蛋白质组分析,并与VFDB数据库进行比对,筛选能在NT001株和NT002株中表达的毒力蛋白;4.通过比较基因组学和比较蛋白质组学的方法,对萜烯诺卡菌NT001株和NT002株进行比较分析,探究影响诺卡菌毒力和不同生长特性的关键因素。结果:1.根据16s rRNA测序鉴定结果,本研究的临床分离株NT001株和NT002株为萜烯诺卡菌,且对常见抗菌药物均敏感。另外,经生长曲线测定实验发现,NT001株生长速度明显快于NT002株;2.萜烯诺卡菌NT001株的基因组完成图显示,该菌株具有1个8.85 Mbp的染色体和1个70 kbp的质粒,可编码7926个CDS。蛋白质组结果分析发现,4336个CDS能够表达;这些蛋白功能多与转录、氨基酸转运和代谢以及能量的产生和转化相关;NT001株的基因组中存在有40个毒力编码基因,共涉及8类毒力因子,功能分别是应激蛋白、铁摄取和铁载体、抗酸性、调节蛋白、分泌系统蛋白、RTX(repeats in toxin)毒素、黏附以及抗吞噬作用;其中有28个毒力编码基因可在蛋白质组中检测到有相应表达。NT001基因组含有6个耐药相关基因,分别为VanRO、VanX、mtrA、rpsL、gryA和rbpA;3.以萜烯诺卡菌NT001株作为参考基因组,对NT002株进行重测序显示,NT002株基因组可拼接成119个contigs,基因组大小为8.87 Mbp的染色体,可编码8659个CDS。蛋白质组结果分析发现,NT002株有4309个CDS能够表达;这些蛋白功能多为转录、氨基酸转运和代谢以及能量的产生和转化相关。NT002基因组中存在42个毒力编码基因,共涉及7类毒力因子,分别为应激蛋白、铁摄取和铁载体、抗酸性、调节蛋白、分泌系统蛋白、黏附和抗吞噬作用;其中蛋白质组结果显示,共有30个毒力编码基因可表达。NT002基因组含有6个耐药相关基因,分别为VanRO、mtrA、rpsL、gyrA、gyrB和rbpA;4.比较基因组分析发现,萜烯诺卡菌NT001和NT002株共有基因为7004个;对共有基因COG功能注释表明,这些基因功能多为转录和维持细菌生存的初级代谢相关。与NT002株基因组比对,NT001株差异基因为1561个,毒力相关基因为RTX毒素的hylB、rtxB、rtxE基因和限制修饰系统(restriction-modification system,R/M)亚基;与NT001株基因组比对,NT002株差异基因为1655个,其中毒力相关基因主要为编码铁载体合成蛋白mbtF、pchE、pchF和isp2,生长相关基因为pccB、mdd、pstP;5.比较蛋白质组学分析发现,萜烯诺卡菌NT001株和NT002株之间有348个差异表达蛋白;NT001株共有190个蛋白表达量高于NT002株,毒力相关蛋白为聚酮合酶、过氧化氢酶、氯过氧化物酶和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶;NT002株存在158个蛋白表达量高于NT001株,毒力相关蛋白主要为甲硫氨酸ABC转运蛋白MetNIQ、半胱氨酸合成蛋白CysMO和硫化氢合成蛋白CysDNCH。结论:1.经NCBI数据库检索,本研究首次获得了萜烯诺卡菌临床分离株的全基因组完成图;2.根据NT001和NT002的比较基因组学分析结果显示,初步筛选到与诺卡菌毒力相关的基因。其中包括,影响生长的基因pccB、mdd、pstP;影响铁摄取和铁载体相关基因mbtA-C、mbtE-I、pchEF、isp2和RTX毒素hlyB、rtxB、rtxE。3.根据NT001和NT002比较蛋白质组分析结果显示,初步发现NT001差异表达蛋白聚酮合酶、过氧化氢酶、氯过氧化物酶、UDP-N-乙酰葡萄糖氨基转移酶,NT002差异表达蛋白甲硫氨酸ABC转运蛋白MetNIQ、半胱氨酸合成蛋白CysMO和硫化氢合成蛋白CysDNCH与诺卡菌的毒力存在一定联系。