目的:肺癌是我国发病率和死亡率均最高的恶性肿瘤。非小细胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌的87%,65%-80%的NSCLC患者确诊时已属中晚期,常失去外科手术机会。顺铂依然是治疗中晚期NSCLC的一线化疗药物。然而,顺铂治疗后会产生获得性耐药和肾脏毒性。目前,顺铂耐药以及肾毒性机制尚未完全阐明,且缺乏有效的减缓或逆转策略,其已成为困扰NSCLC治疗的一大难题。野黄芩苷是存在于天然植物中的一种黄酮类化合物,为传统中药灯盏细辛的主要活性成分,具有提高机体免疫力、抗炎、抗氧化、抗微生物、抗肿瘤等多种药理作用。我们前期研究证实,野黄芩苷能够有效抑制NSCLC细胞的增殖;野黄芩苷能也够增加化疗药博来霉素的抗肝癌活性,并且可以显著减轻博来霉素诱导的肺纤维化毒性,但是目前尚不清楚野黄芩苷能否增强顺铂对NSCLC毒性作用以及减轻顺铂的肾毒性。本实验主要通过体外、体内实验探讨野黄芩苷是否能够协同顺铂杀伤NSCLC细胞;同时通过动物实验考察野黄芩苷对顺铂诱导的急性肾损伤的保护作用并探讨其作用机制。方法:1.野黄芩苷协同顺铂对A549/DDP细胞增殖的影响采用MTT法检测野黄芩苷联合顺铂对A549/DDP细胞增殖的影响,使用CompuSyn软件评价野黄芩苷与顺铂是否具有协同抗肿瘤作用,使用显微镜观察野黄芩苷联合顺铂对A549/DDP细胞形态的影响,采用细胞流式术检测野黄芩苷联合顺铂对A549/DDP细胞周期分布的影响。2.野黄芩苷联合顺铂对A549/DDP细胞凋亡的影响采用细胞流式术检测野黄芩苷联合顺铂对A549/DDP细胞凋亡的影响,采用蛋白印迹法检测野黄芩苷联合顺铂对A549/DDP细胞凋亡蛋白Caspase3、Cleaved caspase3、PARP、p53表达的影响,使用p53抑制剂PFT探讨p53蛋白对野黄芩苷联合顺铂诱导的细胞凋亡的影响,采用蛋白印迹法检测野黄芩苷联合顺铂对A549/DDP细胞ERK蛋白表达的影响,使用ERK抑制剂U0126探讨ERK蛋白对野黄芩苷联合顺铂诱导的细胞凋亡的影响。3.野黄芩苷联合顺铂对A549/DDP细胞自噬的影响采用蛋白印迹法检测野黄芩苷联合顺铂对A549/DDP细胞自噬蛋白LC3、p62表达的影响,采用透射电镜观察A549/DDP细胞自噬小体数量变化,使用自噬抑制剂HCQ探讨自噬在野黄芩苷协同顺铂抗肿瘤中的作用,采用蛋白印迹法检测野黄芩苷联合顺铂对A549/DDP细胞自噬上游蛋白Akt、c-Met以及Stat3的影响,使用Akt或c-Met抑制剂MK-2206以及Crizotinib探讨Akt或c-Met对野黄芩苷协同顺铂诱导自噬以及抑制细胞生长的影响,采用瞬时转染过表达Stat3方法探讨Stat3蛋白对野黄芩苷协同顺铂诱导自噬以及抑制细胞生长的影响。4.野黄芩苷联合顺铂对裸鼠移植瘤生长抑制作用研究构建裸鼠皮下移植瘤模型,采用随机分组法将裸鼠分为对照组、顺铂给药组、野黄芩苷给药组、顺铂联合野黄芩苷组,给药处理21天后,期间测量裸鼠体重、肿瘤体积,采用小动物活体成像系统检测各组裸鼠给药前后荧光强度变化,给药结束后,剥离瘤体,称重,采用蛋白印迹法检测各组肿瘤组织中p-Stat3、c-Met、p-Akt、p62、LC3、ERK、p53的表达情况。5.野黄芩苷对顺铂诱导的肾毒性保护作用研究将C57BL/6小鼠随机分为6组:空白对照组、野黄芩苷60 mg/kg组、顺铂组、顺铂+野黄岑苷30 mg/kg组、顺铂+野黄芩苷60 mg/kg组、顺铂+地塞米松4 mg/kg组。给药组动物预先给予野黄芩苷或地塞米松干预5天,给药结束后,除对照组以及野黄芩苷组之外,其余组小鼠均接受单剂量腹腔注射顺铂,顺铂造模72小时后,称取小鼠体重,收集小鼠血液,处死动物,取小鼠肾脏组织,使用试剂盒检测小鼠血清中BUN和CRE含量,HE染色观察肾脏组织病理学变化,采用ELISA法检测肾脏组织中炎症因子IL-6和TNF-α含量,采用蛋白印迹法检测各组小鼠肾脏组织中IL-6、TNF-α、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、Cleaved PARP、p53、LC3、p62、Atg5、Atg7、Atg12、p-JNK、p-p38、p-ERK、p-Stat3,采用免疫组化法检测各组小鼠肾脏组织中p-JNK、p-p38、p-ERK、p-Stat3 表达情况。结果:1.野黄芩苷协同顺铂对A549/DDP细胞增殖的影响80、120μM野黄芩苷对A549/DDP细胞没有明显的抑制作用,80、120μM野黄芩苷能够协同增强顺铂对A549/DDP增殖抑制作用;当顺铂剂量为10μg/ml,野黄芩苷剂量为120μM的时候,两药协同指数为0.58,两药联用效果最明显;与正常组相比,顺铂处理后细胞形态明显变长,细胞密度明显减少,与顺铂组相比,顺铂+野黄芩苷组细胞形态明显变短,细胞密度明显减少;与正常组相比,顺铂能够将A549/DDP细胞阻滞在G2期,与顺铂组相比,顺铂+野黄芩苷将A549/DDP细胞阻滞在S期。2.野黄芩苷联合顺铂对A549/DDP细胞凋亡的影响与正常组相比,顺铂处理组细胞凋亡率显著升高,与顺铂组相比,顺铂+野黄芩苷组细胞凋亡率明显升高;与正常组相比,顺铂处理组细胞Cleavedcaspase3、PARP、p53、ERK表达上调,与顺铂组相比,顺铂+野黄芩苷组细胞Cleavedcaspase3、PARP、p53、ERK表达上调;p53抑制剂PFT-α能够显著抑制野黄芩苷联合顺铂诱导的细胞凋亡;ERK抑制剂U0126能够显著抑制野黄芩苷联合顺铂激活的p53蛋白表达;ERK抑制剂U0126能够显著抑制野黄芩苷联合顺铂诱导的细胞凋亡。3.野黄芩苷联合顺铂对A549/DDP细胞自噬的影响与正常组相比,顺铂处理组细胞LC3II表达水平明显升高,同时p62表达水平明显下降,自噬小体数量增加,与顺铂组相比,顺铂+野黄芩苷组细胞LC3II表达水平明显升高,同时p62表达水平明显下降,自噬小体数量增加;使用自噬抑制剂HCQ能够显著抑制野黄芩苷对顺铂的增敏作用;与正常组相比,顺铂处理组细胞c-Met表达明显下调,与顺铂组相比,顺铂+野黄芩苷组细胞p-Akt、c-Met表达明显下调;使用Akt抑制剂MK-2206能够显著增强野黄芩苷联合顺铂诱导的自噬;使用c,Met抑制剂Crizotinib能够显著增强野黄芩苷联合顺铂诱导的自噬,同时抑制p-Akt的蛋白表达;使用MK-2206或Crizotinib能够明显增强野黄芩苷联合顺铂对A549/DDP细胞增殖抑制作用;与正常组相比,顺铂处理组细胞p-Stat3表达明显降低,与顺铂组相比,顺铂+野黄芩苷组细胞p-Stat3表达明显降低;过表达p-Stat3能够明显抑制强野黄芩苷联合顺铂诱导的自噬,同时显著降低野黄芩苷联合顺铂对A549/DDP的增殖抑制作用。4.野黄芩苷联合顺铂对裸鼠移植瘤生长抑制作用研究动物实验研究表明,给药21天后,与正常组相比,顺铂组裸鼠移植瘤荧光强度、体积、重量明显明显增加,与顺铂组相比,顺铂+野黄芩苷组裸鼠移植瘤荧光强度、体积、重量明显明显下降;与正常组相比,顺铂组裸鼠体重明显下降,与顺铂组相比,顺铂+野黄芩苷组裸鼠体重明显增加;与对照组相比,顺铂干预组裸鼠肿瘤组织中p-Stat3、c-Met、p-Akt表达均出现显著下调,LC3II表达明显上调,与顺铂组相比,顺铂+野黄芩苷组瘤体组织中p-Stat3、c-Met、p-Akt、p62表达明显下调,p-ERK、p53、LC3II表达明显上调。5.野黄芩苷对顺铂诱导的肾毒性保护作用研究与正常组相比,顺铂模型组小鼠血清中的BUN和CRE值明显升高,与顺铂模型组相比,野黄芩苷高剂量组或地塞米松组小鼠血清中BUN和CRE水平显著降低;顺铂造模后小鼠体重显著下降,野黄芩苷高剂量或地塞米松给药后,小鼠体重明显上升;与正常组相比,顺铂模型组小鼠肾脏皮质肾小球中可见红细胞增多,出现明显的肾小管变性、坏死(胞浆空泡样变),管腔内有大量受损的管型,管腔内可见脱落的上皮细胞,细胞排列紊乱,皮质血管扩张充血,与顺铂模型组相比,野黄芩苷高剂量或地塞米松给药后小鼠病理损伤得到明显改善;与正常组相比,顺铂模型组小鼠肾脏组织中IL-6和TNF-α值明显升高,野黄芩苷高剂量或地塞米松预先给药处理能够显著抑制炎症因子IL-6和TNF-α水平;与正常组相比,顺铂模型组小鼠肾脏组织中Bax/Bcl-2比率和Cleaved caspase-3、Cleaved PARP、p53的蛋白表达水平显著升高,野黄芩苷高剂量或地塞米松预先给药处理能够显著抑制Bax/Bcl-2比率和Cleaved caspase-3、Cleaved PARP、p53的蛋白表达水平;与正常组相比,顺铂模型组小鼠肾脏组织中LC3Ⅱ/Ⅰ比率以及Atg7蛋白表达显著下调,同时p62蛋白表达水平明显上升,野黄芩苷高剂量预先给药处理组小鼠肾组织中LC3Ⅱ/Ⅰ比率Atg7蛋白表达明显增加,p62蛋白水平显著下降;与正常组相比,顺铂模型组小鼠肾脏组织中p-JNK、p-p38、p-ERK、p-Stat3蛋白表达水平明显上升,野黄芩苷高剂量预先给药处理组小鼠肾组织中p-JNK、p-p38、p-ERK、p-Stat3 明显下降。结论:1.野黄芩苷能够协同增加顺铂对A549/DDP耐药细胞的增殖抑制作用;野黄芩苷联合顺铂能够将A549/DDP细胞阻滞在S期;2.野黄芩苷也能够协同增强顺铂对A549/DDP细胞的促凋亡、促自噬作用;3.野黄芩苷联合顺铂能够通过激活A549/DDP细胞ERK/p53信号通路诱导细胞凋亡;4.能够通过抑制c-Met/Akt或Stat3信号通路诱导A549/DDP细胞发生自噬性死亡;5.动物实验证实野黄芩苷能够显著增加顺铂对裸鼠实体瘤生长抑制作用。6.野黄芩苷能够显著改善顺铂导致的小鼠肾功能紊乱和肾脏组织结构的损伤;野黄芩苷能够抑制顺铂诱导的小鼠肾脏组织炎症反应;野黄芩苷能够抑制顺铂诱导的小鼠肾脏组织肾细胞凋亡;野黄芩苷能够提高顺铂抑制的小鼠肾脏组织肾细胞自噬;野黄芩苷能够抑制肾损伤小鼠肾脏组织中MAPK和Stat3信号通路。