研究背景心脏骤停(Cardiacarrest,CA)是指各种原因引起的心脏射血功能突然终止,如果没有积极的干预,往往导致死亡,研宄显示我国每年约有50万人发生心脏骤停。虽然近年来心肺复苏(Cardiopulmonaryresuscitation,CPR)成功率逐渐上升,但心脏骤停患者恢复自主循环后(Return of spontaneous circulation,ROSC)的死亡率仍普遍高于50%。因此,如何改善心脏骤停患者复苏成功后的存活率已成为目前亟待解决的关键问题。心脏骤停后心功能障碍是复苏后髙死亡率的一个关键原因。研究显示,缺血/再灌注损伤、窒息缺氧、复苏时的药物与机械损害是造成心脏骤停后心功能障碍的主要发生机制。目前心脏骤停后心功能障碍的治疗效果仍不理想,因而进一步阐明心脏骤停后心功能障碍的发生机制、寻找保护心脏骤停复苏后心功能的新方法,对减轻急性缺血/再灌注损伤、改善心脏骤停患者的长期存活率具有重要意义。最新研究显示,线粒体活性氧(Reactive oxygen species,ROS)在心脏骤停的发生发展中发挥了重要作用。线粒体ROS不仅促进了急性事件的发生如心肌电不稳定诱发心脏骤停,并且介导了长期慢性心肌重塑和心功能障碍,而抑制线粒体ROS可显著抑制心脏骤停和长期事件的发生。目前关于线粒体ROS的产生机制和靶向抑制线粒体ROS的治疗方法还在研究中。代谢醛类物质是在炎症和细胞损伤时活性氧攻击线粒体膜和胞膜与磷脂成分发生脂质过氧化的一类终末代谢产物,其中4-轻基壬烯醛(4-hydroxy-2-nonenal,4-HNE)含量最为丰富、活性最强。研究发现在心脏骤停复苏后的心肌组织中代谢醛类物质大量増加。对于线粒体来说,代谢醛类物质可通过攻击线粒体蛋白的氨基酸残基损害线粒体功能,但目前代谢醛类物质具体的线粒体蛋白靶点及造成线粒体损伤的具体机制尚不清楚。因而,阐明代谢醛类物质在线粒体损伤中的作用并有效清除这些毒性醛类物质对保护线粒体免于心脏骤停复苏时的缺血/再灌注损伤至关重要。乙醛脱氢酶2(Aldehydedehydrogenase2,ALDH2)是ALDH超家族成员之一,主要位于线粒体基质中。ALDH2可代谢多种醛类物质如4-HNE,减轻细胞氧化应激损伤,对心血管疾病和全身多脏器的缺血/再灌注损伤有重要的保护作用。研究发现ALDH2可调节线粒体自噬、内质网应激、心肌细胞凋亡等多种病理生理过程,但是,ALDH2对心脏骤停后心功能和线粒体ROS是否有作用还未有研究。因而,结合当前国内外研究进展,我们对ALDH2对心脏骤停后心功能的作用和机制进行了研究。研究目的1.研究增强ALDH2活性或蛋白表达对心脏骤停后心功能和存活率的作用。2.研究增强ALDH2活性或蛋白表达对心脏骤停后心肌细胞死亡和线粒体损伤的作用。3.围绕线粒体ROS的产生,研究ALDH2对心脏骤停后心功能障碍的作用机制。研究方法我们采用大鼠心脏骤停复苏模型研究了增强ALDH2活性或蛋白表达对心脏骤停后心功能和存活率、心肌细胞死亡和线粒体损伤的作用;使用大鼠心肌细胞系H9c2和成年小鼠原代心肌细胞建立缺氧/复氧(Hypoxia/reoxygenation,H/R)模型,围绕线粒体ROS的产生研究了ALDH2的作用机制。1.窒息法大鼠心脏骤停复苏模型的建立雄性Wistar大鼠(体重375g-425g)给予腹腔注射戊巴比妥钠(45mg/kg)麻醉,给予气管插管呼吸机辅助通气、股动脉、股静脉插管。根据实验需要,进行Millar心室压力-容积导管插管。使用PowerLab数据采集和分析系统记录血压、左心室压力和心电图。大鼠室息使用关闭呼吸机、夹闭气管插管的方法实现,将平均动脉压(Meanarterial pressure,MAP)<30mmHg时定义为心脏骤停。室息8分钟后,启动呼吸机,进行人工胸外按压(200次/分钟),肾上腺素注射(2(?)g/100g,每隔3分钟给药一次)。自主循环恢复ROSC定义为:恢复窦性心率,MAP(?)60 mm Hg,且持续5分钟以上。若胸外按压和辅助通气持续10分钟,大鼠仍不能恢复自主循环,则认为复苏失败,停止心肺复苏。2.动物实验方案使用ALDH2激动剂Alda-1分别在心脏骤停前30分钟(方案1,n=53)和复苏同时(方案2,n=28)给予大鼠腹腔注射增强ALDH2活性。使用心肌特异性过表达ALDH2的方法增强ALDH2蛋白表达(方案3,n=45),于心脏骤停前4周给予尾静脉注射携带心肌特异性启动子cTNT的ALDH2过表达腺相关病毒AAV9(AAV9-ALDH2)或对照空载体Vehicle病毒(AAV9-Veh)。在每一个实验方案中,根据研究目的及取材时间点的不同将心脏骤停后ROSC的动物进一步分组。在方案1中,研宄了ROSC后1小时心肌线粒体形态的变化;ROSC后4小时心功能和心肌组织学研究,如心肌细胞凋亡、心肌ROS水平、4-HNE水平、心肌酶血浆肌酸激酶MB(Creatine Kinase-MB,CK-MB)、ALDH2活性和蛋白变化;ROSC后72小时存活率、心功能和心肌组织学研究,如心肌细胞凋亡、心肌ROS水平、4-HNE水平、心肌酶CK-MB、ALDH2活性和蛋白变化。在方案2中,我们检测了ROSC后4小时和72小时的心功能,并记录了72小时的存活率。在方案3中,大鼠分别用于研究ROSC后1小时心肌线粒体形态的变化,ROSC后4小时心功能和心肌组织学改变如心肌ROS水平、4-HNE水平。3.细胞实验方案为了研究ALDH2对线粒体是否有保护作用,我们使用H9c2细胞给予H/R模型,检测了线粒体ROS水平、线粒体呼吸功能、ATP水平和醛4-HNE水平。为了研宄ALDH2抑制线粒体ROS的作用机制,我们给予H9c2细胞4-HNE刺激,观察线粒体ROS水平,并通过检测加入4-HNE后的琥珀酸含量,及抑制琥珀酸后线粒体ROS的变化研宄了4-HNE促进线粒体ROS产生的机制。另外,我们使用ALDH2敲基因成年小鼠原代心肌细胞进行了Alda-1对ALDH2作用的特异性研宄。4.心功能的检测在方案1中,我们使用Millar压力-容积导管持续监测ROSC后4小时内的心功能,使用心脏超声检测ROSC后72时心功能;在方案2和方案3中,我们使用心脏超声检测ROSC后1小时、2小时、3小时、4小时或72小时的心功能。5.心肌细胞凋亡检测心肌组织用4%多聚甲醛固定后,石蜡包埋、切片。TUNEL染色检测心肌细胞凋亡水平。6.线粒体形态检测心肌组织用戊二醛固定后,于山东大学电镜中心进行透射电子显微镜检查,使用Flameng评分对线粒体结构破坏的严重程度进行半定量分析。7.心脏组织活性氧检测心肌组织用OCT冰冻包埋剂包埋后切片,使用DHE荧光染料染色,并用DAPI复染细胞核,荧光显微镜下观察后用ImageJ软件量化分析荧光强度。8.血浆肌酸激酶MB(CK-MB)水平检测取血于EDTA抗凝采血管中,将全血在4℃以l000g离心20分钟,收集上清使用ELISA试剂盒检测。9.血气测定分别在大鼠ROSC后15分钟、1小时和4小时取动脉血,并立即使用自动血气分析仪检测(pH、Pa02、PaC02、葡萄糖和乳酸盐)。10.ALDH2活性检测提取心肌线粒体蛋白后,利用ALDH2具有脱氢酶活性,通过加入代谢底物检测ALDH2代谢NAD+生成NADH的量反映ALDH2酶活性。11.蛋白检测取30[ig的组织蛋白或细胞蛋白通过western blot,检测ALDH2和4-HNE的表达水平。12.细胞缺氧/复氧处理细胞正常培养的气体成分为95%空气+5%二氧化碳。缺氧时气体成分为94%氮气+5%二氧化碳+1%氧气。将细胞缺氧培养4小时后,在正常条件下再培养2小时,进行H/R处理。13.细胞活性氧和线粒体活性氧的检测使用荧光探针DCFH-DA和MitoSOXRed分别检测细胞ROS和线粒体ROS水平,在荧光显微镜下观察后采用ImageJ软件量化分析荧光强度。14.细胞线粒体呼吸功能的检测使用Seahorse XFe24细胞线粒体压力测试盒,通过检测细胞耗氧量(Oxygen consumption rate,OCR)来测定线粒体呼吸功能。15.细胞ATP、琥珀酸的测定收集细胞裂解液后使用相应的试剂盒进行检测,使用多功能酶标仪检测吸光度后通过标准曲线计算结果。结果1.动物实验的基线和模型数据在3个研究方案中,增强ALDH2活性或蛋白表达其基线和模型数据与对照组相比没有显著差异,包括体重、心率、MAP、左室心排量(Cardiacoutput,CO)、左室射血分数(Ejection fraction,EF)、左室缩短分数(Fractional shortening,FS)、心脏骤停持续时间、CPR持续时间和ROSC%。2.激活ALDH2有效改善了心脏骤停后心功能和存活率在研究方案1和研究方案2中,我们发现与CA-CPR组相比,CA-CPR+Alda-1组的4小时左室心功能有明显改善。另外,我们发现增强ALDH2活性可改善ROSC后72小时心功能和72小时存活率,差异有统计学意义。通过检测大鼠心脏骤停复苏后ALDH2的蛋白表达和活性水平,发现大鼠ROSC后4小时、72小时ALDH2的蛋白表达没有明显改变,但ALDH2活性分别下降了58.8%、64.8%,而Alda-1可明显恢复ALDH2活性,这初步解释了增强ALDH2活性可改善心脏骤停后心功能和存活率的原因。3.激活ALDH2减轻了心脏骤停后心肌细胞死亡和线粒体损伤我们使用研究方案1中的心肌组织进行了心肌组织学和心肌酶检测。使用TUNEL染色发现与对照组相比,大鼠ROSC后4小时、72小时心肌细胞凋亡比例明显增加,而Alda-1可显著减少心肌细胞凋亡比例。使用Flameng评分对线粒体结构破坏的严重程度进行了半定量分析,发现ROSC后1小时线粒体明显受损,而Alda-1可显著改善线粒体结构。另外,ROSC后心肌细胞ROS水平和4-HNE蛋白加合物的水平明显增加,Alda-1可显著降低心肌细胞ROS和4-HNE蛋白加合物水平。4.ALDH2过表达可改善心脏骤停后心功能障碍为了进一步明确ALDH2的心肌保护作用,我们研究了ALDH2过表达对心脏骤停后心功能的作用,发现与对照组相比,心肌特异性过表达ALDH2改善了ROSC后4小时内的左室EF、心肌细胞ROS和4-HNE蛋白加合物的水平及ROSC后1小时的线粒体结构。以上结果说明通过酶激活和蛋白过表达来增强ALDH2作用的这两种方法都能有效改善心脏骤停后心功能障碍。5.Alda-1可特异性激活ALDH2并抑制心肌细胞缺氧/复氧后的线粒体ROS产生H9c2细胞H/R后线粒体ROS水平增加至Con组的5.7倍,与H/R组相比,Alda-1显著减少了线粒体ROS水平,且Alda-1改善了ATP水平和线粒体的呼吸功能。另外,我们使用来自ALDH2敲基因小鼠和对照小鼠的原代心肌细胞研究了Alda-1对ALDH2作用的特异性,发现H/R后线粒体ROS水平明显升高,而ALDH2基因敲除后线粒体ROS水平进一步升高,但是将Alda-1加入ALDH2敲基因的心肌细胞后并没有改善其线粒体ROS水平,Alda-1也没有改善ALDH2敲基因心肌细胞H/R后受损的线粒体呼吸功能。这些结果表明ALDH2是Alda-1线粒体功能保护作用中的特异性靶点。6.心肌细胞缺氧/复氧后4-HNE增加并促进了线粒体ROS产生由于代谢醛类物质是造成线粒体损伤的一个重要因素,且是ALDH2的主要作用靶点,我们进一步研究了ALDH2是否通过代谢毒性醛类物质减少了线粒体ROS产生。我们发现H9c2细胞H/R后4-HNE水平明显升高,且4-HNE可显著增加H9c2细胞的线粒体ROS水平。为了研究4-HNE引起线粒体ROS产生的机制,结合最新研究发现缺血时琥珀酸大量聚集是引起再灌注时线粒体ROS产生的重要因素,我们探索了4-HNE是否参与了这一过程。我们发现4-HNE可增加琥珀酸含量并呈浓度依赖关系,且增加了线粒体膜电位。我们进一步通过免疫沉淀发现4-HNE增加了琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydrogenase,SDH)的豫基修饰。且使用號拍酸抑制剂DMM可抑制4-HNE引起的线粒体ROS升高。这些结果提示醛4-HNE介导了琥珀酸聚集和线粒体ROS的产生,并解释了ALDH2可抑制细胞H/R时线粒体ROS产生的机制。结论1.增强ALDH2活性或蛋白表达可改善心脏骤停后心功能障碍,减轻心肌细胞死亡和线粒体损伤。2.4-HNE可增加琥珀酸含量并引起线粒体ROS产生,ALDH2通过清除4-HNE抑制了线粒体ROS产生。