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目的自身免疫性葡萄膜炎是一大类眼部炎症为主的疾病,累及的范围可包括:葡萄膜、视网膜、视网膜血管以及玻璃体。该病多发生于中青年,分类繁多、易于复发。传统的治疗药物包括糖皮质激素以及一些免疫抑制剂。但由于长期使用可导致全身和局部严重并发症,安全有效的新型治疗方法亟需开发。本实验室既往研究显示在复发性实验性自身免疫性葡萄膜炎(recurrent experimental autoimmune uveitis,r EAU)大鼠模型的疾病早期,通过静脉注射间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)可有效防止疾病进展。尽管多项临床实验证明MSCs治疗在有广泛临床转化前景,但在合理治疗方案方面仍缺乏标准化路径,需要更多实验数据支持。在本实验中,我们试图通过r EAU动物模型,观察MSCs在疾病晚期的治疗效果,为临床治疗提供理论基础。方法1.贴壁法培养Wistar大鼠骨髓MSCs,随后分离及鉴定。2.建立Lewis大鼠r EAU模型:首先行单侧后肢足垫皮下注射混合抗原主动免疫Lewis大鼠制造EAU模型:光感受器间维生素A类结合蛋白(photoreceptor retinoid binding protein,IRBP)的多肽片段R16;结核杆菌素以及完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA)等量体积进行充分地混合与乳化。免疫后10天收集EAU大鼠淋巴结及脾脏制成T淋巴细胞单细胞悬液,经过射线处理作为抗原提呈细胞(antigen presenting cells,APC)与T细胞在R16的刺激下共培养48小时后,收集激活的T细胞经尾静脉注射Lewis大鼠体内建立r EAU模型。3.利用MSCs进行治疗:免疫后的大鼠行尾静脉注射5*106MSCs细胞悬浮液1ml/天,连续3天进行治疗,对照组行等体积PBS注射,连续3天。分为早期治疗组(第4天开始治疗),晚期治疗组(第20天开始治疗),重复治疗组(第4天及第20天均治疗)。4.r EAU临床评分:采用临床上的裂隙灯来观察EAU大鼠眼部前房炎症反应,每天记录评分至过继免疫后40天,根据发病次数及炎症程度采用Caspi临床评分分为0-4等级。5.r EAU病理评分:过继免疫40天后,将大鼠处死并取双侧眼球制备视网膜组织切片行HE染色后观察病理学改变。并将组织病理学改变进行评分分为0-4等级,0为无病理性变化,4为严重病理性改变。并且利用视网膜全层级外核层厚度来进行视网膜损害的评价。6.视网膜电图(electroretinogram,ERG)记录:利用记录过继免疫后第10、15、20、25、30、35、40天的暗适应后的ERG结果来评定大鼠视网膜功能。7.光学相干断层扫描(Optical coherence tomography,OCT):过继免疫40天后,利用海德堡HRA+OCT系统对视网膜进行断层扫描并评分0-4等级来评价治疗组及对照组的差别。8.免疫组织化学染色:取上述制备好的视网膜组织切片,利用免疫组化SP法来检测各个不同分组视网膜中胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和视紫红质(rhodopsin,RHO)的表达。结果1.成功培养,传代纯化并鉴定大鼠MSCs。2.大鼠r EAU模型的成功建立。3.前房炎症反应一直观察至过继免疫后40天。与对照组相比,早期治疗组和重复治疗组中眼内炎症临床评分达高峰的次数及平均评分均明显降低,但晚期治疗组只降低了平均评分并未减少疾病复发的次数。4.组织病理显示MSC治疗组相比较于模型对照组,明显减低了组织病理学评分,视网膜全层及外核层的厚度增加。但早期治疗组与重复治疗组之间并无统计学差异。5.ERG显示MSC治疗组在疾病晚期阶段检测指标暗适应的0.01a/b波和3.0a波治疗组振幅均明显高于对照组。其他指标也显示此趋势,但无统计学差异。6.OCT显示MSC治疗组相比较于对照组,有更好的视网膜结构,玻璃体腔内有较少的炎性细胞(高反射点),视网膜层间较少炎性细胞(高反射团块)。7.所有MSC治疗组,包括晚期治疗组均减少了GFAP的表达,早期治疗组RHO表达量接近于正常,晚期治疗组的RHO表达量仍高于模型对照组。结论早期采用MSC治疗r EAU临床治疗效果显著,在疾病晚期进行治疗也可有效阻止视网膜结构和功能的损坏。间隔较长的重复治疗比单次治疗更有效。