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背景:脑缺血/再灌注损伤(cerebral ischemia/reperfusion injury,CIRI)是导致缺血性脑卒中病情恶化的重要原因,是指脑缺血后血液供应恢复但脑功能损伤反而加重的病理改变。CIRI的病理变化涉及一系列复杂的时间、空间级联反应,首先是脑组织局部缺血导致神经元出现能量障碍,进而引起细胞内钙超载、兴奋性氨基酸过量释放、氧自由基生成增多、炎症因子释放增加,最终导致神经元死亡等不可逆的脑损伤。因氧化应激在上述级联反应中扮演了极为重要的角色,因此近年来抗氧化应激治疗CIRI成为了研究的热点,也得到了临床及基础研究的肯定。天然虾青素(Astaxanthin,ASX)是一种安全、高效的具有强抗氧化活性的类胡萝卜素,可以顺利通过血脑屏障直接作用于脑组织,发挥抗氧化应激、抗炎、免疫调节和对抗细胞凋亡等多种作用,在预防和治疗CIRI中表现出了巨大潜力,目前仅有少量研究发现其可缩小啮齿类动物CIRI后的脑梗死体积、改善动物神经功能缺损评分,其作用机制也不十分清楚。本研究利用目前公认的线栓所致大鼠大脑中动脉阻塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R)模型,按照预防性及治疗性两种给药方案,分两部分探讨研究ASX的保护作用及其机制。第一部分观察研究预防性给予天然ASX对大鼠脑CIRI损伤是否具有保护作用及抗氧化应激作用,并初步探讨其抗氧化应激反应的机制;第二部分为了对临床更具有应用指导意义,实验研究治疗性给予天然ASX对大鼠CIRI损伤的保护作用和抗氧化应激作用,并通过Nrf2/ARE信号通路探讨天然ASX对大鼠脑CIRI保护作用的可能机制,现分述如下。第一部分预防性给予天然虾青素对大鼠缺血/再灌注损伤的保护作用研究目的:观察研究预防性给予天然ASX对MCAO/R模型大鼠是否具有保护作用并初步探讨其可能机制。方法:1.110只SD雄性大鼠随机分为5组,分别为假手术组(sham operation group,SOG)、模型组(model group,MG)、依达拉奉阳性对照组(positive control group,PCG)、高剂量虾青素组(high-dose ASX group,HAG)和低剂量虾青素组(low-dose ASX group,LAG),每组22只。各组均给予药物/溶剂预处理,其中SOG及MG灌胃给予花生油(10 mg/kg);PCG腹腔注射依达拉奉(10 mg/kg);HAG和LAG分别灌胃给予10mg/kg和5 mg/kg的天然虾青素(花生油配制)。2.各组预给药7d后,复制大鼠MCAO/R模型,分别于缺血2h后再灌注2h及再灌注24h时进行神经病学评分。3.于再灌注24h时处死动物,取缺血侧脑组织进行TTC染色,检测脑梗死体积;制备脑组织石蜡切片进行HE染色,显微镜下对梗死区的顶叶皮质进行病理学观察。4.制备缺血侧脑组织石蜡切片,采用免疫组织化学方法,检测CIRI后生长相关蛋白-43(GAP-43)、脑神经营养因子(BDNF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、微管相关蛋白-2(MAP-2)及细胞凋亡相关因子Bcl-2、BAX的表达。5.酶学方法检测动物血清中SOD、MDA含量。6.实时定量PCR法检测梗死侧脑组织Nrf2/ARE信号通路相关因子Nrf2、HO-1、NQO1的m RNA表达。结果:1.预防性给予天然ASX可降低MCAO/R模型大鼠再灌注2h及24h时的神经病学评分,同MG相比,HAG和LAG均有统计学差异(HAG:P<0.01,LAG:P<0.05)。2.预防性给予天然ASX可显著降低MCAO/R模型大鼠的脑梗死体积,药物干预各组与MG相比均有显著性差异(P<0.01)。3.预防性给予天然ASX可减轻MCAO/R模型大鼠脑梗死区顶叶皮层组织病理学损伤,PCG、HAG脑组织的病理显现较MG更佳,表现为脑组织排列较紧密整体,细胞计数多,少量液化性坏死。4.预防性给予高剂量天然ASX后,损伤侧顶叶皮质部脑组织中神经相关蛋白GAP-43、BDNF、MAP-2、GFAP含量较MG均有明显增加(P<0.05)。HAG、LAG较MG均促进了抗凋亡基因Bcl-2的阳性细胞表达(HAG,LAG:P<0.05);HAG较MG明显减少促凋亡基因BAX阳性细胞表达(P<0.01)。5.预防性给予高剂量天然ASX可减轻MCAO/R模型大鼠的氧化应激反应,表现为同MG相较外周血SOD水平升高(P<0.05)、MDA水平降低(P<0.05)。6.与SOG相比,MG大鼠明显上调了Nrf2/ARE信号通路中Nrf2及其下游基因HO-1、NQO1的m RNA表达(Nrf2,HO-1,NQO1:P<0.05),预防性给予高剂量天然ASX较MG可进一步激活上述m RNA表达(Nrf2,HO-1,NQO1:P<0.05)。结论:1.预防性给予天然ASX能显著减轻MCAO/R模型大鼠CIRI损伤,发挥明显的保护作用。2.预防性给予天然ASX能显著减轻MCAO/R模型大鼠氧化应激反应。3.预防性给予天然ASX对MCAO/R模型大鼠的保护作用可能是通过上调Nrf2及其下游基因HO-1、NQO1的m RNA表达,从而激活抗氧化应激反应信号通路Nrf2/ARE来实现的。第二部分治疗性给予天然虾青素对大鼠缺血/再灌注损伤的保护作用及机制探索目的:实验研究治疗性给予天然ASX对MCAO/R模型大鼠的保护作用并探索其可能机制。方法:1.30只体重为250~300克的SD雄性大鼠随机分为5组,每组6只,按照第一部分步骤制备MCAO/R模型,在再灌注后1、3、5、7、14 d五个时间点处死动物,取损伤侧脑组织皮层及海马,利用Western-blot技术测定Nrf2蛋白表达量,绘制其动态表达曲线,判断截止干预的时间点。2.根据Nrf2蛋白动态表达,将84只体重为250~300克的SD雄性大鼠随机分成假手术组(SOG)、模型组(MG)、依达拉奉阳性对照组(PCG,10 mg/kg)和天然ASX组(HAG,10 mg/kg),每组21只。其中SOG和MG给予等体积的溶剂(花生油),给药组分别灌胃给予受试物,手术后4.5小时开始给药,每天1次,连续给药7天。于再灌注后7d时处死动物,处死前应用Longa 5分法及走平衡木实验进行神经功能及行为学评分;取缺血侧脑组织进行TTC染色,检测脑梗死体积;制备脑组织石蜡切片进行HE染色,显微镜下对梗死区顶叶皮层进行病理学观察;酶学方法检测动物缺血侧脑组织上清液中8-OHd G含量;Western-blot法检测脑组织损伤侧相关区域Nrf2、HO-1的总蛋白表达。3.制备脑组织冰冻切片,免疫荧光组织化学法检测Nrf2、HO-1的阳性细胞数量并观察其细胞内定位。结果:1.Nrf2在MCAO/R模型大鼠再灌注后的表达从第3d开始逐渐降低(较第1d),至第7d到达谷值,3到14d整体表达基本稳定,将截止干预点设定为再灌注后7d。2.神经病学及行为学评测显示,治疗性给予天然ASX可降低MCAO/R模型大鼠再灌注7d的Longa评分,升高走平衡木实验评分,与MG相比有显著性差异(P<0.05)。3.脑组织TTC染色显示,与MG比较,治疗性给予天然ASX可显著降低MCAO/R模型大鼠的脑梗死体积(P<0.05)。4.损伤侧顶叶皮层HE染色显微镜观察显示,治疗性给予天然ASX可减轻MCAO/R模型大鼠损伤脑区组织病理学损伤,同MG相比,神经细胞计数显著增多,排列紧密。5.ELISA检测结果显示,与MG相比,治疗性给予天然ASX可降低脑组织上清液中8-Ohd G水平(P<0.05)。6.Western-blot法显示,与MG相比,治疗性给予天然ASX可增加MCAO/R模型大鼠Nrf2/ARE信号通路中Nrf2(HAG,PCG:P<0.01)及HO-1(HAG:P<0.05,PCG:P<0.01)的总蛋白表达。7.免疫组织化学荧光法结果显示,与MG相比,治疗性给予天然ASX可增加MCAO/R模型大鼠脑组织中Nrf2(HAG,PCG:P<0.01)、HO-1(HAG,PCG:P<0.01)阳性细胞表达数量,并影响上述蛋白在细胞核内外的转移。结论:1.治疗性给予天然ASX能显著减轻MCAO/R模型大鼠CIRI损伤,发挥明显的保护作用。2.治疗性给予天然ASX能显著减轻MCAO/R模型大鼠的氧化应激反应。3.治疗性给予天然ASX对MCAO/R模型大鼠的保护作用可能是通过上调Nrf2及其下游蛋白HO-1的表达,从而激活抗氧化应激反应通路Nrf2/ARE来实现的。总结:1.预防性和治疗性给予天然ASX均对MCAO/R模型大鼠有保护作用。2.预防性和治疗性给予天然ASX均可对抗大鼠CIRI引发的氧化应激反应。3.天然ASX可上调Nrf2/ARE通路中相关m RNA和蛋白的表达,这可能是其发挥保护作用的机制之一。