乙型脑炎病毒属于黄病毒科，黄病毒属，主要由蚊虫传播，临床上可以引起严重的病毒性脑炎症状。乙型脑炎主要流行于东南亚地区，但近些年来该病的流行区域不断扩大，现已扩展到日本和澳大利亚等地区。全球每年约有35，000～50，000乙脑病例报告，其中约10，000～15，000人死亡，幸存者中约30％～50％的病人留下不可逆的神经系统症状和认知障碍等精神疾病。尽管目前针对乙型脑炎病毒有相应的疫苗进行接种预防，但它的高致死性及区域扩散性依然引起国际社会的广泛关注。　　乙型脑炎病毒为单股正链RNA病毒，基因组长度约为11，000nt，包括5非编码序列(5NCR)，3非编码序列(3NCR)和中间的单一开放阅读框(ORF)。ORF可以编码三种结构蛋白C，prM，E以及七种非结构蛋白NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B和NS5。病毒基因组5端有I型帽子结构(m7GpppAmG)但是其3端缺少多聚腺苷酸poly(A)尾巴。帽子结构对于mRNA的转运，翻译以及稳定性至关重要。　　mRNA的加帽过程一般需要四种酶，分别是RNA三磷酸酶，鸟苷酸转移酶，N7和2-O甲基转移酶。由于黄病毒在宿主细胞质中复制，不能利用宿主的N7和2-O甲基转移酶，因此进化出了自己的甲基转移酶系统。黄病毒NS5蛋白的N端具有甲基转移酶活性，可以催化病毒RNA帽子结构的N7和2-O甲基化。目前对于黄病毒甲基转移酶以及病毒RNA帽子甲基化的了解主要来自于对西尼罗病毒和登革病毒的研究，但是乙型脑炎病毒的相关研究却较为滞后，其甲基转移酶体外活性分析方法也尚未建立。因此本研究的目的是建立乙脑病毒N7和2-O甲基转移酶体外活性分析体系，并筛选出对甲基转移酶活性具有影响的关键位点，进而测定2-O甲基转移酶功能缺失对于病毒生物学特征的影响，最后探索将2-O甲基转移酶功能缺陷型乙脑病毒作为减毒活疫苗候选株的可行性。　　1.乙脑病毒甲基转移酶体外活性分析方法的建立及酶活性关键位点筛选　　为了建立乙脑病毒甲基转移酶体外活性分析方法，首先我们在大肠杆菌中重组表达并纯化了乙脑病毒的甲基转移酶蛋白，纯化后的重组蛋白大小约为35kDa，纯度大于95％。然后我们通过PCR和体外转录获得乙脑病毒5UTR起始190nt的pppA-RNA，将其作为加帽反应的底物。继而利用牛痘病毒的加帽酶系统对pppA-RNA进行加帽，获得G*pppA-RNA或者m7G*pppA-RNA（*表示后面的第一个P被放射性标记）分别作为N7和2-O甲基化反应的底物。在登革病毒甲基转移酶活性测定方法的基础上，我们对乙脑病毒RNA的N7和2-O甲基化反应的盐离子浓度，温度，时间等条件进行优化，建立了测定乙脑病毒N7和2-O甲基转移酶体外活性的最佳反应条件和分析方法。在此基础上，我们通过定点突变的方法测定NS5蛋白K61-D146-K182-E218四分体氨基酸位点突变对于乙脑病毒N7和2-O甲基转移酶功能的影响。结果显示，乙脑病毒NS5蛋白的K61A，D146A，K182A，E218A位点突变均会完全破坏2-O甲基转移酶功能，而对于N7甲基转移酶活性，除D146A完全破坏外，其它三个突变位点K61A，K182A和E218A均保留了部分N7甲基转移酶活性。这些结果表明K61，D146，K182和E218位点对于乙脑病毒2-O甲基转移酶执行其功能是必需的，而D146对N7甲基转移酶执行其功能是必需的。　　2.2-O甲基转移酶功能缺失对乙脑病毒生物学特征的影响　　为了研究2-O甲基转移酶功能的缺失对于乙脑病毒生物学特征的影响，我们通过定点突变的方法将K61A，D146A，K182A和E218A分别引入到乙脑病毒全长感染性克隆的质粒上，经线性化和体外转录后，我们将病毒转录体RNA转染BHK-21细胞，最终获得了K61A和E218A两株2-O甲基转移酶功能缺陷型重组乙脑病毒(D146A，K182A致死)。进而，我们测定了突变型和野生型乙脑病毒的生物学特征，包括病毒蛋白的表达，噬斑形态，在细胞上的增殖特征，基因组的遗传稳定性，在小鼠中的神经毒力和神经侵袭力以及对干扰素和IFIT(IFNinducedproteinswithtetra-tricopeptiderepeats)的敏感性等。结果发现，在转染等量病毒RNA的BHK-21细胞中，突变病毒E蛋白的表达水平与野生型相当;突变病毒的噬斑远小于野生型;突变病毒在多种细胞系中均可以良好的复制，复制效率略低于野生型;突变病毒具有良好的遗传稳定性;突变病毒在小鼠上丧失神经侵袭力，并且神经毒力较野生型病毒明显降低;小鼠感染突变病毒后无病毒血症出现，同时突变病毒在小鼠颅内的复制效率降低;突变病毒在神经细胞上的增殖能力与野生型相比降低;机制上，我们发现突变病毒对干扰素和IFIT的抗病毒作用与野生型病毒相比更为敏感。综上，2-O甲基转移酶功能缺失使乙脑病毒显示出良好的减毒特征，而这种减毒特征可能与突变病毒对宿主干扰素以及IFIT的抗病毒作用更为敏感有关。　　3.2-O甲基转移酶功能缺陷型乙脑病毒的免疫原性和免疫保护性研究　　为了探索将2-O甲基转移酶功能缺陷型乙脑病毒作为减毒活疫苗候选株的可行性，我们继而对其免疫原性和免疫保护性进行了研究。将104PFU的重组突变病毒以皮下注射方式免疫BALB/c小鼠，在免疫后的二周和四周分别采血并测定血清中IgG抗体及JEV特异性中和抗体水平，同时测定诱导产生的细胞免疫水平。结果发现，单次免疫即可诱导小鼠产生高水平的IgG抗体以及JEV特异的中和抗体，其中免疫四周后的中和抗体滴度高达1∶97。同时脾细胞增殖和IFN-γ产生实验结果说明，重组病毒免疫还可以诱导产生一定的细胞免疫。为了验证免疫的效果，我们用致死剂量的异型的野生型乙脑病毒感染免疫后的小鼠，结果发现，PBS对照组的小鼠全部死亡，而重组突变病毒免疫组的小鼠全部存活。这说明2-O甲基转移酶功能缺陷型乙脑病毒单次免疫即可对小鼠产生完全保护。　　综上所述，本研究建立了乙型脑炎病毒N7和2-O甲基转移酶体外活性分析体系，在此基础上测定了保守关键位点突变对甲基转移酶功能的影响以及2-O甲基转移酶功能缺失对于病毒生物学特征的影响。这些研究完善了我们对黄病毒甲基转移酶及RNA帽子结构甲基化的了解，同时深化了对病毒和宿主的相互作用关系的认识。另一方面，2-O甲基转移酶缺陷型乙脑病毒在细胞中复制良好，在体内和体外高度减毒而且减毒机制明确，遗传稳定性好，同时具有很好的免疫原性和免疫保护性。因此，它可以被作为一种理性设计的减毒活疫苗候选株，同时这种基于2-O甲基转移酶的靶向减毒策略也可以应用于其他病毒。