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山羊绒是一种珍贵的特种动物纤维,具有极高的经济价值。阿尔巴斯绒山羊是经过长期自然选育形成的优良地方性绒肉兼用型品种,生产的山羊绒品质上乘,但产绒量偏低,故培育高产绒量的绒山羊新品系显得十分重要。相对于传统育种,现代生物技术可以极大程度缩短育种所需时间,为农业生物新品种培育提供了新的技术途径。血管内皮细胞生长因子在调控血管内皮细胞分裂和迁移中具有重要作用,能够调节血管内外渗透压,并为新血管的生成提供条件,具有诱导毛囊形态发生及调控毛发生长周期的作用,该因子在绒山羊皮肤的过表达可以增加羊绒产量。成纤维细胞生长因子5(Fibroblast growth factor 5,FGF5)对毛发生长有负调控作用,敲除FGF5后能延长毛发的生长期,延缓进入退行期,从而延长毛发生长时间,获得长毛的新性状。本实验使用CRISPR/Cas9技术在绒山羊胎儿成纤维细胞FGF5位点定点整合VEGF基因,实现VEGF基因过表达的同时完成FGF5基因的敲除。然后通过体细胞核移植技术获得VEGF基因在FGF5位点定点整合的绒山羊,为培育高产优质阿尔巴斯绒山羊新品种提供育种材料。1、VEGF基因定点整合载体的构建构建了Cas9/gRNA共表达载体,并利用surveyor酶对gRNA的切割效率进行检测。其次,构建了由FGF5显子上游片段、毛囊特异性启动子Kap6.1、VEGF基因、polyA、FGF5外显子下游片段连接而成的VEGF打靶载体。2、VEGF基因定点整合单克隆细胞株的获得通过电穿孔转染法将经酶切线性化的VEGF打靶载体和Cas9/gRNA共表达载体共同转入绒山羊胎儿成纤维细胞中,48h后通过流式细胞仪将单个细胞接种至96孔板中培养,后提取细胞基因组,PCR鉴定及测序,筛选出阳性VEGF基因定点整合细胞株。本实验共得到121株单克隆细胞,经鉴定5株发生VEGF基因定点整合,定点整合效率为4.1%。3、VEGF基因定点整合绒山羊的制备通过机械切割从463个卵巢中采集到卵母细胞1824枚,经体外培养获得成熟卵母细胞936枚,成熟率为51.3%;通过体细胞核移植去除成熟卵母细胞的细胞核和极体,置入VEGF基因定点整合的胎儿成纤维细胞,获得重构胚848枚,两次电融合后591枚成功融合,融合率为69.7%;融合后的重构胚经体外培养,其中367枚发生卵裂,卵裂率为62.1%。将卵裂后的重构胚移植入131只受体羊输卵管中,次年获得2只羊羔。采取羊羔血样提取基因组进行初步鉴定,其中有一只PCR结果为阳性,且测序正确,另一只仍需进一步检测。本实验通过CRISPR/Cas9技术获得了VEGF基因在FGF5位点定点整合的绒山羊,为培育高产优质绒山羊新品系奠定了基础。