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猪流行性腹泻(Porcine Epizootic Diarrhea,PED)是猪流行性腹泻病毒(Porcine Epizootic Diarrhea Virus,PEDV)引起的新生仔猪的一种肠道传染病。主要引起仔猪的急性水样腹泻、呕吐和脱水,导致新生仔猪死亡率高达80%-100%。一般不能引起成年猪死亡。该病在上世纪70年代首次在欧洲被发现,后来,在亚洲国家也多有发生,2013年首次在美国爆发。是近年来对我国养猪业造成影响最大的传染病之一。由于该病毒又出现新的变异株,致使经典的疫苗株制备的弱毒疫苗和灭活疫苗已不能很好地保护新生仔猪的感染和死亡。所以急需研制一种新型的PEDV疫苗来应对PEDV的爆发。病毒样颗粒(Virus-like Particles,VLPs)是由病毒的一种或几种结构蛋白组装形成的空心的病毒外壳。其不含病毒核酸,安全性高;其保持真实病毒的天然构象,具有较好的免疫原性。我们在该研究中利用流行毒株的主要结构蛋白基因,通过昆虫-杆状病毒表达系统来构建和生产PEDV VLPs,并对其免疫原性进行初步研究。我们选择了PEDV流行毒株的纤突蛋白(Spike Protein,S)、膜蛋白(Membrane protein,M)和包膜蛋白(Envelop Protein,E)基因构建重组质粒pFastBac-Dual-2S、pFastBac-Dual-2M、pFastBac-Dual-2E,并进一步拯救了重组杆状病毒rpFastBac-Dual-2S、rpFastBac-Dual-2M、rp FastBac-Dual-2E,以共感染的方式感染Sf9细胞制备出PEDV VLPs。对制备的PEDV VLPs我们分别通过透射电镜观察、间接免疫荧光和Western Blotting方法对其外部形态和组成成分进行鉴定。结果表明,我们获得了外部形态与原始病毒外部形态相似的PEDV VLPs;而且我们获得的PEDV VLPs是由PEDV的主要结构蛋白S、M和E蛋白共同组装形成。通过肌肉注射免疫小鼠,对PEDV VLPs的免疫原性进行初步分析。检测血清中和抗体效价、ELISpot分析和胞内因子染色分析结果表明,PEDV VLPs能够诱导机体产生较高水平的抗PEDV中和抗体,与对照组相比,表现出极显著的差异。说明PEDV VLPs具有很好的免疫原性。而且在免疫PEDV VLPs的小鼠中,诱导脾淋巴细胞产生了较高水平的IFN-γ和IL-4;经CD4+T细胞和CD8+T细胞双染色分析表明,CD4+T细胞和CD8+T细胞均产生了较高水平的IFN-γ和IL-4;且与对照组相比,差异显著。表明PEDV VLPs能够诱导小鼠机体分别产生细胞免疫和体液免疫。因此,以PEDV VLPs为基础开发PEDV疫苗具有潜在的发展空间。PEDV主要引起新生仔猪的胃肠道病变,所以我们考虑到免疫接种的疫苗应以能够诱导怀孕母猪的粘膜免疫为主,使新生仔猪能够获得足够的粘膜免疫的抗体sIgA。基于此,我们在PEDV VLPs的基础上,又构建了表达CTB融合蛋白基因的重组质粒pFastBac-Dual-2CTB,并进一步拯救重组杆状病毒rpFastBac-Dual-2CTB,使rpFastBac-Dual-2CTB与rpFastBac-Dual-2S、rpFastBac-Dual-2M、rp FastBac-Dual-2E共感染Sf9细胞,制备出嵌合CTB的嵌合型PEDV VLPs。对于制备的嵌合CTB的嵌合型PEDV VLPs,我们分别通过透射电镜观察、间接免疫荧光和Western Blotting方法对其外部形态和组成成分进行鉴定。结果表明,我们获得了外部形态与原始病毒相似的嵌合CTB的嵌合型PEDV VLPs。利用嵌合CTB的嵌合型PEDV VLPs口服免疫小鼠和猪,经血清中和抗体检测分析表明,在小鼠和猪的血清中均产生了较高水平的抗PEDV中和抗体;在小鼠的小肠液和猪的初乳中也分别检测到了较高水平的sIgA抗体。证明嵌合CTB的嵌合型PEDV VLPs不仅能够诱导机体产生系统性免疫应答,还能刺激机体产生局部的体液免疫应答。经ELISpot分析和细胞内因子双染色分析表明,嵌合CTB的嵌合型PEDV VLPs经口服免疫均能刺激小鼠脾淋巴细胞产生较高水平的IFN-γ和IL-4。表明嵌合CTB的PEDV VLPs能刺激机体产生强烈的细胞免疫和体液免疫应答。综上所述,我们以昆虫-杆状病毒为表达系统生产的PEDV VLPs具有很好的免疫原性,表明以PEDV VLPs为基础,开发抗PEDV疫苗的研究有着广阔的发展空间和发展潜力。在本试验中,我们选择了能够刺激粘膜免疫的CTB作为粘膜免疫疫苗的分子佐剂,构建嵌合CTB的嵌合型PEDV VLPs进行口服免疫,取得了良好的免疫效果。本研究为抗PEDV粘膜免疫疫苗的研究提供了一定的理论基础和数据参考。