线粒体在动物卵泡发育、卵子成熟及其后续胚胎发育的过程中发挥了极其重要的作用。核呼吸因子-1(NRF-1)不仅能够调控线粒体DNA复制和转录，还对抗氧化相关基因的表达有重要调节作用。过氧化物酶体增生激活受体γ协同刺激因子(PGC-1α)是线粒体转录协同刺激因子，在调节细胞代谢和线粒体功能方面发挥重要作用。NRF-1与PGC-1α能协同促进线粒体增殖，并对胚胎早期发育有重要作用，然而其在家畜中的研究较少，值得深入研究。　　转基因家畜在生物制药和畜牧业有着非常广泛的应用。基因打靶和体细胞核移植等技术为转基因动物生产提供了有效的技术手段。Myostatin基因对骨骼肌的生长有负调控作用，其突变会导致动物具有“双肌”性状。因此，通过基因打靶对Myostatin进行定向调节，能够有效提高畜禽产肉性能，为培育优良内用家畜提供新的途径。　　本研究以山羊卵巢和卵母细胞为研究对象，重点研究了NRF-1和PGC-1α在胎羊和新生羔羊卵巢卵泡发育以及卵母细胞氧化应激中的作用:通过HE染色分析总结山羊卵巢卵泡早期发育规律;通过TUNEL法和caspase-3活性检测分析卵巢卵泡以及卵母细胞的凋亡情况;通过免疫组织化学研究NRF-1和PGC-1α蛋白在卵巢卵泡形成和早期发育中的定位;通过实时荧光定量PCR分析NRF-1和PGC-1α基因在各年龄段山羊卵巢中的表达以及NRF-1、PGC-1α、BAX和Bcl-2基因在卵母细胞和卵丘细胞中的表达;同时我们检测了成熟卵母细胞氧化应激过程中的GSH含量变化。另外，我们通过体细胞核移植技术，选取Myostatin打靶山羊成纤维细胞作为供体细胞，进行Myostatin打靶山羊制备的研究，主要包括Myostatin打靶转基因细胞的准备、血清饥饿对供体细胞的影响和不同来源卵母细胞对转基因克隆羊生产效率的影响等内容，为高效生产Myostatin打靶转基因山羊提供理论参考。　　1.NRF-1和PGC-1α在山羊卵巢卵泡发育中的作用研究　　本试验以胎60日龄（胎羊）到出生后30日龄（羔羊）的山羊卵巢组织为研究对象，研究NRF-1和PGC-1α在山羊卵泡发育过程中的作用及其与卵巢细胞凋亡的关系。结果显示，在胎羊或羔羊卵巢中，卵母细胞巢是最早能识别的生殖细胞。在胎60日龄至120日龄卵巢中，卵母细胞巢比例从92.68％减少到25.08％,而单个卵泡比例从7.32％升高到74.92％;在胎90日龄至120日龄卵巢中，原始卵泡比例从9.98％升高到61.56％(P＜0.01);在新生1日龄到出生30日龄的羔羊卵巢中卵母细胞巢和原始卵泡比例没有发现显著变化（P=0.12）。另外，胎90日龄到新生1日龄卵巢中初级卵泡比例从1.23％升高到37.93％(P=0.01)，但是新生1日龄到出生30日龄卵巢中初级卵泡比例没有发现显著变化(P=0.11)。同时，次级卵泡和三级卵泡比例随着日龄的增加而逐渐增多。另一方面，NRF-1蛋白主要在胎羊卵母细胞巢、原始卵泡和初级卵泡的卵母细胞胞质中表达，PGC-1α蛋白主要在胎羊和羔羊卵母细胞巢和各发育阶段卵泡的卵母细胞胞质中表达。胎60日龄卵巢中NRF-1基因的表达水平显著高于新生1日龄羔羊卵巢(P＜0.05)，而PGC-1α基因的表达水平差异不显著（P=0.05）。此外，胎60日龄卵巢中的凋亡细胞数和caspase-3活性明显比新生1日龄羔羊卵巢少(P＜0.01，P=0.01)。综上所述，山羊原始卵泡形成主要发生在胎90至120日龄，原始卵泡向初级卵泡转换主要胎120日龄至新生1日龄。在胎羊和羔羊卵巢卵泡发育过程中，NRF-1和PGC-1α可能参与调控卵巢细胞凋亡。　　2.氧化应激对山羊卵母细胞体外成熟的影响　　本试验拟建立卵母细胞体外氧化损伤模型，研究氧化应激对山羊卵母细胞成熟和孤雌胚胎早期发育的影响。结果表明:山羊卵母细胞体外成熟培养液中添加100μM H2O2能够导致卵母细胞发生氧化应激，表现为成熟率下降，孤雌胚胎发育速度增加，孤雌囊胚形成率降低;添加200μM胱氨酸和半胱氨酸(CYS)能够缓解卵母细胞氧化应激，表现为成熟率升高，孤雌囊胚率恢复到正常组水平;本试验还发现卵母细胞和克隆胚胎培养液中添加CYS有利于转基因克隆胚胎的早期发育。另外，检测成熟卵母细胞中谷胱甘肽(GSH)含量发现，相比正常组(3.18pmol/oocyte)，H2O2组中卵母细胞GSH含量降低(0.31pmol/oocyte)(P＜0.05)，添加CYS后，GSH含量升高(7.53pmol/oocyte)(P＜0.05)。综上所述，卵母细胞成熟培养液中添加100μM H2O2能够诱导山羊卵母细胞体外成熟过程中发生氧化损伤，而在卵母细胞成熟培养液中添加200μMCYS能够很好地发挥抗氧化作用。　　3.NRF-1和PGC-1α在山羊卵母细胞氧化应激中的作用研究　　上述研究表明氧化应激导致卵母细胞体外成熟率成熟率下降，孤雌囊胚形成率降低，而线粒体特异性转录因子NRF-1和PGC-1α与细胞增殖和抗氧化有关，并在山羊卵巢卵泡早期发育中发挥重要作用。因此，本试验通过体外培养山羊卵母细胞，采取TUNEL染色、caspase-3活性检测和荧光定量PCR等方法，研究NRF-1和PGC-1α在山羊卵母细胞氧化应激中的作用。结果表明:氧化应激后卵母细胞TUNEL阳性细胞数(121cells/COCs)显著高于正常组(7.8cells/COCs)(P＜0.05)，添加CYS后TUNEL阳性细胞数(36cells/COCs)显著低于应激组(P＜0.05);氧化应激对卵母细胞caspase-3活性没有明显影响(86.4vs79.3pmol/oocyte，P＞0.05)，但是添加CYS后caspase-3活性显著下降(61.4pmol/oocyte)(P＜0.05)。通过荧光定量PCR检测NRF-1、PGC-1α、BAX和Bcl-2基因表达发现，H2O2诱导的氧化应激导致成熟卵母细胞中NRF-1和PGC-lα基因表达量以及BAX/Bcl-2比值显著升高(P＜0.05），而CYS处理后，NRF-1和PGC-1α基因表达量以及BAX/Bcl-2比值显著低于应激组(P＜0.05);另外，卵丘细胞中这些基因的表达模式与成熟卵母细胞相似，而未成熟卵母细胞中的基因表达模式与成熟卵母细胞相反。综上所述，氧化应激导致山羊卵母细胞凋亡水平升高，而NRF-1和PGC-1α可能参与调节山羊卵母细胞氧化损伤。　　4.Myostatin打靶克隆山羊制备的研究　　本试验对山羊耳成纤维细胞进行Myostatin打靶载体转染，利用获得的阳性转基因细胞作为供体细胞，通过体细胞核移植(SCNT)的方法生产Myostatin打靶转基因山羊。首先，将制备好的Myostatin打靶载体通过脂质体共转染到2月龄的黄淮山羊耳成纤维细胞中。对获得的转基因细胞进行血清饥饿处理3天，结果发现G0/G1期细胞比例显著高于没有血清饥饿的转基因细胞(82.9vs66.2％，P＜0.05)，但是没有发现细胞凋亡率和线粒体膜电位产生明显变化(P＞0.05)。另外，本试验分析了体内和体外成熟来源的卵母细胞作为胞质受体的差异，结果发现两种来源的卵母细胞在融合率(86.5vs78.4％)、妊娠率(21.6vs16.7％)和产羔率(2.7vs0％)方面都没有显著差异(P＞0.05)。不过，体内来源的卵母细胞最终获得1只克隆羊，但是羔羊出生后2小时死亡。对所获得的克隆山羊进行微卫星和PCR分析，证实了其基因遗传上来源于供体细胞，western blot检测也发现获得的转基因克隆山羊Myostatin蛋白表达量非常低。综上所述，本试验利用SCNT和基因打靶技术成功生产出1只Myostatin打靶克隆山羊，优化了Myostatin打靶克隆山羊生产体系，为优良肉用山羊培育提供了理论参考。　　综上所述，山羊原始卵泡形成主要是在胎90至胎120日龄，而原始卵泡向初级卵泡转换主要是在胎120日龄至新生1日龄;在山羊卵巢卵泡早期发育和卵母细胞氧化应激中，NRF-1和PGC-1α可能参与了调控卵巢细胞凋亡和卵母细胞抗氧化损伤机制;本研究通过SCNT和基因打靶技术成功生产出1只Myostatin打靶克隆山羊，为优良肉用山羊培育提供了理论参考。