论文部分内容阅读
多形性胶质母细胞瘤（GBM）是成人最常见、恶性度最高的原发脑肿瘤，WHO将其归类为Ⅳ级星形细胞瘤。尽管手术技术不断进步，放疗结合新一代化疗药物的应用，GBM患者的预后仍然极差，中位生存期仅为15个月左右，迫切需要新的治疗方法。近年提出针对肿瘤抗原的“抗体导向”治疗新理念，以抗体为载体，将药物导向肿瘤病灶，提高药物疗效，减少药物毒副作用，代表肿瘤免疫治疗的新方向。多药耐药相关蛋白3（MRP3）在人类GBM实体瘤和细胞系中均呈高水平表达，且表达于肿瘤细胞膜表面。相反，MRP3在正常脑组织中不表达。因此，MRP3可作为抗体导向治疗GBM的理想分子靶点。2010年，Kuan等利用噬菌体展示技术，分离得到抗MRP3的人源重组单链抗体（scFv），能够与人类MRP3胞外区N端的氨基酸残基特异性结合，是抗体导向治疗GBM的理想抗体分子。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL），又称凋亡素-2配体（APO-2L），属TNF超家族成员，通过与死亡受体TRAIL-R1（DR4）和TRAIL-R2（DR5）结合，激活外源性凋亡途径，诱导caspase依赖的细胞凋亡。TRAIL具有显著的凋亡肿瘤细胞凋亡活性而对正常细胞没有毒性，被视为最具有临床应用前景的抗癌药物之一。天然TRAIL为膜结合型，其胞外区含有蛋白酶作用位点，可以从细胞膜上被剪切下来，或通过mRNA剪接作用，形成可溶性TRAIL（sTRAIL），仍然保留天然TRAIL的选择性凋亡诱导活性。本研究利用基因重组技术，首次将抗MRP3的单链抗体与仅对肿瘤细胞有很强杀伤作用的sTRAIL通过柔性氨基酸连接臂(Gly4-Ser)3相连，构建抗MRP3的单链抗体与sTRAIL的融合蛋白，命名为antiMRP3(scFv)-sTRAIL，以期通过antiMRP3(scFv)与MRP3的特异结合，加强sTRAIL在GBM细胞膜表面的富集，达到靶向诱导GBM凋亡的目的。本论文将从以下三部分阐述antiMRP3(scFv)-sTRAIL融合蛋白对GBM的靶向凋亡诱导作用及其机制。第一部分antiMRP3(scFv)-sTRAIL融合蛋白的诱导表达、纯化及其生物学活性鉴定利用pMAL原核表达系统诱导表达与纯化antiMRP3(scFv)-sTRAIL融合蛋白，并鉴定其生物学活性。通过重组PCR技术分别扩增antiMRP3(scFv)和sTRAIL基因片段，插入原核表达质粒pMAL-c2，构建重组表达质粒pMAL-antiMRP3(scFv)-sTRAIL，经菌落PCR、酶切鉴定及DNA测序证明构建的重组质粒与预期完全一致。将重组质粒转化感受态E.coli BL21，IPTG诱导表达，得到带有麦芽糖结合蛋白（MBP）标签肽的antiMRP3(scFv)-sTRAIL融合蛋白，经Amylose Resin亲和层析柱纯化，SDS-PAGE鉴定纯化的融合蛋白。结果显示，在92kD处观察到纯化的融合蛋白条带。融合蛋白在E.coli BL21中的表达率约30%，纯化的融合蛋白纯度达95%。以MRP3阳性U251多形性胶质母细胞瘤细胞为研究对象，用MTT法分别测定不同浓度antiMRP3(scFv)-sTRAIL融合蛋白和MBP蛋白作用24h后对U251细胞的增殖抑制率，结果表明antiMRP3(scFv)-sTRAIL融合蛋白可显著抑制U251细胞的增殖并呈浓度依赖性，而MBP蛋白无明显作用。应用IC50剂量（62.5nmol/L）的antiMRP3(scFv)-sTRAIL融合蛋白作用U251细胞24h后，倒置显微镜下观察U251细胞形态的改变。antiMRP3(scFv)-sTRAIL融合蛋白处理组U251细胞在形态学上呈现明显细胞凋亡改变，而MBP蛋白组和未处理组细胞未发生异常形态改变。上述结果表明成功构建了pMAL-antiMRP3(scFv)-sTRAIL重组质粒，并实现了原核表达与纯化antiMRP3(scFv)-sTRAIL融合蛋白。初步的生物学功能鉴定表明该融合蛋白具有显著诱导U251多形性胶质母细胞瘤细胞凋亡的活性，为进一步研究其对U251细胞的靶向凋亡诱导作用和机制奠定了基础。第二部分antiMRP3(scFv)-sTRAIL融合蛋白对U251多形性胶质母细胞瘤的靶向凋亡诱导作用通过荧光激活细胞分选技术（FACS）分析antiMRP3(scFv)-sTRAIL融合蛋白与MRP3阳性U251细胞和MRP3阴性Jurkat细胞的抗原特异性结合。结果显示antiMRP3(scFv)-sTRAIL融合蛋白可特异性结合至MRP3阳性U251细胞膜表面，其结合可被亲代antiMRP3(scFv)竞争性阻断，而antiMRP3(scFv)-sTRAIL融合蛋白与MRP3阴性Jurkat细胞未见明显细胞膜表面结合，表明antiMRP3(scFv)-sTRAIL融合蛋白与U251细胞的结合为MRP3抗原特异性。观察应用亲代antiMRP3(scFv)竞争性阻断antiMRP3(scFv)-sTRAIL与MRP3的靶向结合，或TRAIL活性中和抗体mAb2E5中和sTRAIL活性，对antiMRP3(scFv)-sTRAIL融合蛋白凋亡诱导活性的影响。用MTT法检测应用不同浓度antiMRP3(scFv)-sTRAIL作用于U251细胞24h后的细胞存活率，结果显示antiMRP3(scFv)-sTRAIL呈现较强杀伤U251细胞作用，在24h内随融合蛋白浓度增加，U251细胞存活率逐渐降低。应用antiMRP3(scFv)或mAb2E5预孵育后，antiMRP3(scFv)-sTRAIL对U251细胞的杀伤作用被显著抑制，各浓度梯度下均无明显的杀伤活性，MBP蛋白对U251细胞的存活率没有影响。用流式细胞仪检测IC50剂量（62.5nmol/L）的antiMRP3(scFv)-sTRAIL作用8h、12h、24h后U251细胞的凋亡情况，与亲代antiMRP3(scFv)和未处理组对比得出，antiMRP3(scFv)-sTRAIL作用8h时U251细胞即发生明显凋亡，24h内细胞凋亡率随诱导时间延长而上升。应用antiMRP3(scFv)或mAb2E5预孵育，antiMRP3(scFv)-sTRAIL对U251细胞的凋亡诱导作用被完全阻断，结果与MTT检测相符。上述结果表明，作为抗体导向的免疫毒素，antiMRP3(scFv)-sTRAIL融合蛋白仅与MRP3阳性U251细胞靶向结合并诱导其凋亡，其结合为MRP3抗原特异性。antiMRP3(scFv)-sTRAIL融合蛋白的凋亡诱导活性可被亲代antiMRP3(scFv)竞争性抑制或被TRAIL活性中和抗体阻断，由此证明antiMRP3(scFv)-sTRAIL通过antiMRP3(scFv)单链抗体导向部分特异性结合MRP3抗原，实现靶向诱导GBM细胞凋亡，其凋亡诱导活性是由sTRAIL部分介导的，而非靶向结合的antiMRP3(scFv)-sTRAIL不具备明显凋亡诱导活性。第三部分antiMRP3(scFv)-sTRAIL融合蛋白对TRAIL-R1和TRAIL-R2的激活作用TRAIL-R1（DR4）和TRAIL-R2（DR5）是介导外源性细胞凋亡途径的两种死亡受体，其中DR5在多种肿瘤中的表达水平高于DR4，因而在诱导肿瘤凋亡中处于主导地位。研究表明，天然膜结合型TRAIL可激活TRAIL-R1和TRAIL-R2两种死亡受体，而可溶性sTRAIL只保留了对TRAIL-R1的激活作用。为分析antiMRP3(scFv)-sTRAIL对U251细胞两种死亡受体的激活情况，用real-time PCR法首先分析U251细胞中TRAIL-R1和TRAIL-R2的mRNA表达水平，结果表明TRAIL-R1和TRAIL-R2在U251细胞中均呈阳性表达，其中TRAIL-R2的表达水平高于TRAIL-R1。用抗-TRAIL-R1和抗-TRAIL-R2阻断抗体孵育U251细胞1h，分别单独或同时阻断TRAIL-R1和TRAIL-R2，然后应用IC50剂量的antiMRP3(scFv)-sTRAIL处理U251细胞24h，流式细胞仪检测细胞凋亡率，分析antiMRP3(scFv)-sTRAIL对两种死亡受体的激活作用。结果显示，阻断TRAIL-R1凋亡率下降28%，阻断TRAIL-R2凋亡率下降35%，同时阻断TRAIL-R1和TRAIL-R2凋亡率下降46%。最后，用Western blot方法验证了antiMRP3(scFv)-sTRAIL融合蛋白激活外源性凋亡途径，诱导caspase依赖的细胞凋亡。上述结果表明，antiMRP3(scFv)-sTRAIL融合蛋白与靶抗原特异性结合将sTRAIL由可溶性形式转变为天然TRAIL的膜结合型形式，不仅能够激活TRAIL-R1，而且恢复了其对TRAIL-R2的激活能力，增强sTRAIL的凋亡诱导活性，从而获得增强的抗肿瘤作用。antiMRP3(scFv)-sTRAIL融合蛋白通过结合TRAIL-R1和/或TRAIL-R2两种死亡受体，激活外源性细胞凋亡途径，诱导caspase依赖的细胞凋亡。