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神经营养素-3(neurotrophin-3，NT-3)是由774个氨基酸组成的、与神经结构和功能密切相关的神经营养因子，调控着神经元的发育、生长、分化和生存，对维持神经系统的正常功能起着重要作用，也是内耳发育最基本的营养因子。我们采用RT-PCR的方法，从人肝脏组织中克隆NT-3 cDNA基因，构建携带绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)标签的真核表达载体pIRES2-EGFP-NT-3，并采用阳离子脂质体介导的方法，将其分别转染耳蜗内不同组织细胞，观察转染细胞NT-3表达和分布情况；将阳离子脂质体-质粒复合物微量注入豚鼠耳蜗，观察其对豚鼠庆大霉素耳毒性听力损失的保护作用，为今后的临床治疗研究提供实验依据。结果如下： 一、NT-3-cDNA基因的克隆、重组质粒pIRES2-EGFP-NT-3的构建及其表达活性的检测 1．NT-3-cDNA基因的克隆及重组真核表达载体的构建 针对人的NT-3-cDNA序列，设计了包含起始密码子和终止密码子的一对引物，分别在其5′端加上EcoR I及BamH I酶切位点，经RT-PCR扩增的774bp的特异性片段插入到pUC19载体后筛选出pUC19-NT-3-cDNA阳性克隆，经序列测定，证实与序列号“NT-3 002527”的同源性为100％。将测序正确质粒pUC19-NT-3进行经EeoR I/BamH I双酶切，切下的NT-3片段定向克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP，随机挑选数个菌落，提取质粒，经EcoR I/BamH I双酶切及PCR鉴定，成功构建重组质粒pIRES2-EGFP-NT-3。 2．稳定表达NT-3的NIH3T3细胞的建立及鉴定 以阳离子脂质体作为载体，将携带有外源性基因NT-3的重组质粒pIRES2-EGFP-NT-3转染小鼠成纤维细胞，并进行RT-PCR、Western-blot及 第四军医大学博士学位论文一免疫组化鉴定。结果：得到抗G－418的阳性细胞克隆；RT－PCR的产物约为744hP；Western－b1Ot可见一清晰的蛋白条带，与 NT－3的蛋白分于量相符合。NT－3免疫组化染色结果显示转染W－3－CDNA的NIH3T3细胞胞质呈棕黄色着色。 二、NTo 4外转染对耳阑组织细胞生长的影口 1．重组质粒PIRBSZoGFPoT刁 ＃染对豚鼠耳蜗成纤维细胞生长的形响 用阳离子脂质体介导的方法将真核表达载体PIRESZ｛GFP十T卡瞬时转染豚鼠原代耳蜗成纤维细胞，转染48h后分别在荧光显微镜下及用免疫组化方法观察转染细胞表达NT－3的情况。结果：转染后48h在荧光显微镜下观察到呈绿色荧光的成纤维细胞，NT－3免疫组化染色结果显示转染NT－3的成纤维细胞胞浆呈棕黄色着色，转染空载体的成纤维细胞免疫组化染色呈阴性。 2．重组质粒PIRBSZ卫GFP－NT刁 ＃染对豚巴耳蜗雪旺氏细聪生长的形响 采用阳性脂质体介导法将重组质粒PIRESZ－EGFP－NT－3转染雪旺细胞，观察外源性NT上对雪旺细胞生物学行为的影响。结果：分离、纯化得到高纯度的雪旺细胞；将重组质粒转染雪旺细胞，与对照组相比，转染NT－3基因的雪旺细胞不仅细胞形态正常，经NT－3抗体免疫组化染色见NT－3转染组雪旺细胞胞浆呈深棕色着色，轴突着色清晰可见，与对照组相比，细胞突起明显变长；空载体转染组及空白对照组胞浆及轴突着色均较淡，对各组胞浆着色进行半定量分析结果表明，NT－3基因转染组其灰度值显著低于对照组 （P＜0．05）。 3．重组质粒PIRBSZ－－BGFPW3 ＃染肿秩耳蜗螺旋神经节细胞生长的形响 成功培养了小鼠耳蜗螺旋神经节细胞（SGC），该细胞胞体透明，胞浆匀质，折光性能好，细胞状态稳定。我们利用阳离子脂质体作为载体，将重组质粒PIRESZ｛GFP十T上瞬时转染小鼠原代耳蜗螺旋神经节细胞，观察螺旋 ·3。 第四军医大学博士学位论文——神经节细胞的形态、数量等改变。结果发现：转染48h后，与未转染细胞相比，螺旋神经节细胞形态未见明显变化。用波长488urn的紫外线激发，荧光显微镜下见聚合分布的、胞体及轴突发出绿色荧光的螺旋神经节细胞。培养ZW后，各实验组细胞的数量均减少，但NT－3转染组减少细胞的数量低于空载体组及空白对照组。说明外源性的NT－3成功导入部分螺旋神经节细胞内，并且对螺旋神经节细胞的生长起到了一定的促进作用。 4．稳定表达NT3的NIH3T3细胞与小鼠耳绢螺旋神经节细胞的共鞭实验 我们建立了能够稳定表达、分泌NT－3蛋白的NIH3T3细胞系，通过与耳蜗螺旋神经节细胞的共培养实验，了解SGC的生长情况。实验发现，与对照组相比，NIH3T3十T七共培养组SGC的数量以及突起的长度均显著高于对照组，由此可以看出，当大量给予外源性的NT－3时，可明显减轻耳蜗螺旋神经节细胞的退行性改变。 三、NTo 4内转染对豚巨耳蜗的保护作用 1．NT刁 ＄因转染豚鼠耳蜗的安全性检测 采用脂质体介导的方法，将真核表达载体PIRESZ－EGFP－NT－3与阳离子脂质体复合物 10UI注入豚鼠左侧耳蜗，分别在术后 id、ZW、4W取材，观察转染基因在耳蜗及脑干等部位的表达和分布情况，同时，分别在术前?