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对肝癌样本的基因芯片筛查结果显示JMJD5基因在很多肝癌样本中的表达发生了下调,结合JMJD5的结构特点,提示说JMJD5可能可以作为一个潜在的抑癌基因。RT-PCR和Real-Time PCR的结果显示JMJD5在约70-80%的肝癌样本中的表达发生了下调。生长曲线,平板克隆形成和软琼脂克隆形成的结果显示,JMJD5的过表达抑制了某些肝癌细胞株的生长,如LM3,LM6,Huh7,MHCC-H,MHCC-L。而3T3转化实验显示将JMJD5 RNA干扰掉后导致了3T3的恶性转变,形成了克隆。流式细胞仪分析周期变化发现,过表达JMJD5可以使得LM3,LM6,Huh7细胞的G2/M期发生了阻滞,可能是导致细胞生长受到抑制的原因。Western Blot的结果显示JMJD5的过表达可以使得H3K36me2变成H3K36me1。
在实验室的前期工作筛选了在X染色体上对肝癌细胞的生长有影响的肿瘤-睾丸基因或类似肿瘤睾丸基因。结果发现RNA干扰靶基因DUSP21能够抑制肝癌细胞Focus,PLC/PRF/5两株肝癌细胞的生长,并且能都抑制肝癌细胞株的克隆形成能力。通过RT-PCR和Real-Time PCR发现DUSP21在大约30-40%的肝癌样本中表达发生了上调,上调结果在组织芯片的结果中得到了验证。DAC,TSA药物处理肝癌细胞株,发现DAC处理之后DUSP21的表达发生了上调,提示表观遗传学调节机制在DUSP21在肝癌中的上调中发挥着重要的作用。裸鼠皮下成瘤实验证明RNA干扰DUSP21的腺病毒(Ad-84)瘤内注射后可以抑制瘤的生长,Ad-84感染PLC/PRF/5后做瘤内注射成瘤实验得到了同样的结果。用Western Blot的结果显示,RNA干扰DUSP21能够导致P38磷酸化的上升,而P38在肝癌发生中被认为是一个抑癌基因,因此猜测DUSP21可能是通过P38通路发挥其作用。但是我们用免疫共沉淀以及免疫荧光的方式检测不到DUSP21与P38的共定位。在细胞的培养上清中可以检测外源性DUSP21的表达,提示DUSP21可能是一种分泌蛋白,可以作为潜在的检测肝癌存在的分子标志物。由于DUSP21作为肿瘤-睾丸基因的组织表达的特异性,被认为可以作为治疗肝癌的候选靶点,但是还没有筛选出特异性针对DUSP21的小分子抑制物,矾酸钠对DUSP21具有明显的抑制作用,但是由于对DUSPs家族的广谱的抑制作用限制了它的使用。
本研究旨在建立可用于活体成像的小鼠肝癌移植瘤模型。利用脂质体将荧光素酶表达载体pGL3(LUC/NEO)转染至人肝癌细胞株SMMC-7721,Huh-7,Hep3B,MHCC-97H,HCC-LM6,PLC/PRF/5中,经G418筛选获得稳定表达荧光素酶的细胞克隆。根据体外生物发光情况及细胞的生长特性,从中挑选合适克隆,进行裸鼠皮下接种,建立肝癌移植瘤模型。利用活体成像系统监测肿瘤的生长转移情况,并对肝脏组织进行HE染色分析肿瘤细胞的生长分布特点。建立了六株肝癌细胞株的荧光素酶基因稳定表达的亚克隆,并且体外验证了各种细胞株中的荧光素酶活性情况;裸鼠皮下成瘤实验显示了SMMC-7721Luc+,Huh7Luc+,PLC/PRF/5Luc+, MHCC-97HLuc+稳定细胞具有成瘤特性;裸鼠肝脏原位注射肝癌细胞(SMMC-7721Luc+ ,MHCC-97H Luc+,HCC-LM6 Luc+ ,PLC/PRF/5 Luc+),利用活体成像系统能够有效对活体肿瘤生长情况进行监测;裸鼠脾动脉注射肝癌细胞(MHCC-97H Luc+,PLC/PRF/5 Luc+),利用活体成像系统能够监测到小鼠肝癌模型的生长状况,之后处死小鼠,对肝脏组织HE染色发现肝癌细胞局部分布于肝脏中。本研究成功地构建了可用于活体成像的小鼠肝癌移植瘤模型,模型稳定可靠、直观、灵敏,为肿瘤生长转移机制的研究及抗肿瘤药物的研发提供了重要工具。