胚胎干细胞(ES细胞)具有自我更新及多向分化潜能,为发育学、遗传学、人类疾病的发病机理与替代治疗等研究提供非常宝贵的资源。自日本和美国研究小组先后用四种基因将小鼠(2006年8月)和人(2007年11-12月)的体细胞在体外重编程为诱导性多潜能干细胞(Induced pluripotent stem cells, iPS cells),在短短5年多时间内,iPS细胞的研究和关注度呈爆炸式增长,并且取得了一些突破性的进展。由于iPS细胞技术较经典的体内外重编程方法存在巨大优势,科学家们纷纷开始利用此项技术进行体细胞及肿瘤细胞重编程研究。iPS细胞技术是借助基因导入技术将某些特定因子基因导入动物或人的体细胞,以将其重编程或诱导为ES细胞样的细胞,即iPS细胞。目前,常用的iPS细胞技术包括通过逆转录病毒、慢病毒和腺病毒等介导的方式,这些方法均可将转录因子对应的基因导入体细胞,进而将其重编程为iPS细胞。现阶段常见的iPS细胞制备流程包括(1)分离和培养宿主细胞;(2)通过逆转录病毒、慢病毒或腺病毒等介导的方式将外源基因导入宿主细胞；(3)病毒感染后的细胞消化传代于饲养层细胞上,并以ES细胞专用培养体系来培养,同时在培养基中根据需要加入相应的小分子物质以促进重编程；(4)数天后,出现ES细胞样的克隆。通过上述方法得到的iPS细胞一般在克隆形态、生长特性、表面标志物、基因表达模式、表观遗传学特征、拟胚体形成、畸胎瘤形成和嵌合体形成(针对动物)等方面与ES细胞的非常相似,因而从以上几个方面对重编程后的细胞进行鉴定。为了更好地将iPS细胞技术与临床应用相结合,科学家们经过大量研究,获得了一系列令人欣慰的成果,包括成功将小鼠、大鼠、恒河猴和人等的体细胞在体外重编程为iPS细胞,并成功建立了个体特异的或疾病特异的人iPS细胞系；开启了借助转座子介导的转基因方法高效率将转座子表达载体导入体细胞,并将其重编程为virus-free iPS细胞；已有科学家从所获得的动物和人的iPS细胞中移除先前导入的重编程因子基因,从而获得近似治疗型的i PS细胞(Virus-free和先前导入的重编程因子基因已被删除)等等。上述这些成就又进一步加大了科学家们研究iPS细胞技术的热情,关于iPS细胞的研究经久不衰,并一次次在生命科学领域引起轰动。而继成功将鼠和人的体细胞重编程为iPS细胞后,科学家们开始思考将肿瘤细胞重编程为iPS细胞的可能性,这一猜想也很快得到了证实。2008年,Shi-LungLin等将miR302s导入黑色素瘤细胞和前列腺癌细胞,成功将肿瘤细胞重编程为iPS细胞。2009年7月Hochedlinger课题组用Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4四基因将小鼠黑色素瘤细胞重编程为iPS细胞,2010年,Jan E等成功利用Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4四因子将慢性粒细胞白血病细胞重编程为iPS细胞。上述研究成果证实了从理论上来说,任何一种(小鼠或人的)体细胞以及肿瘤细胞均可被特定的因子重编程为iPS细胞。也就是说,被逆转的细胞不局限于特定的细胞类型及特定的分化阶段,其可以是内中外三胚层任一胚层来源的细胞,既可以来源于胚胎细胞,也可以来源于新生儿、成人甚至是终末分化的成熟细胞。而关于肿瘤细胞重编程为iPS细胞的研究,也为在体外研究肿瘤细胞重编程提供了重要的技术手段和技术平台,同时为临床肿瘤治疗开启了新思路。研究表明,体细胞或者肿瘤细胞重编程为iPS细胞所需转录因子组合需根据细胞种类及其上相应转录因子表达水平或额外加入的小分子加以灵活选择。般情况下,Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4组合即可将体细胞重编程为iPS细胞。适当选用小分子化合物加入重编程,可大幅度提高重编程效率和／或减少转录因子使用个数,而当增加转录因子使用个数(0ct4、Sox2、Nanog、Lin28、c-Myc和K1f4),也可大幅度提高重编程效率慢病毒基因投递系统是目前较为常用的基因导入技术,借助慢病毒基因投递系统可将慢病毒中携带的外源基因高效整合进宿主基因组中,并且此外源基因可在宿主体内长期稳定表达。过去用科学家们采用分别携带Oct4、K1f4、c-Myc和Sox2四种基因的慢病毒载体进行病毒生产,然后将病毒以一定的比例混合感染目的细胞诱导体细胞及肿瘤细胞重编程。而为了更高效地完成重编程,选择同时携带Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四种重要基因的载体,可以让这四种基因更好地发挥协同作用,并且长期保持在一稳定水平,更有利于细胞发生重编程。报告基因EGFP的存在,使重编程的过程更为可视化,通过观察绿色荧光的表达情况,可以判断慢病毒将外源基因整合进宿主基因组的效率,并且在重编程过程中更加直观地了解重编程的进程,有利于对实验结果的分析。鉴于此,本试验拟借助慢病毒载体法将同时携带Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四种基因和报告基因绿色荧光蛋白(EGFP)的载体pLentG-KOSM导入小鼠肝癌细胞(Hep1-6),以开展肿瘤细胞体外重编程研究,在此基础上构筑小鼠肿瘤细胞体外重编程的技术平台。方法：1慢病毒载体pLentG-KOSM的鉴定酶切鉴定Not Ⅰ、Xba Ⅰ线性化pLentG-KOSM,线性化产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。PCR鉴定根据Oct4、K1f4、c-Myc和Sox2序列设计引物分别扩增Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2基因；PCR扩增后,取5μl反应液进行3%琼脂糖凝胶电泳。2慢病毒生产与滴度测定慢病毒包装按标准程序进行慢病毒包装(脂质体介导的瞬时转染)。慢病毒滴度测定用5μl病毒上清感染15万293T细胞,48h后4%多聚甲醛固定,DAPI染色,荧光显微镜下计数EGFP阳性细胞和总细胞数,将其带入公式：病毒滴度(IU/ml)=EGFP阳性细胞数/总细胞数÷5×1.5×105×103。3慢病毒载体法重编程Hep1-6细胞用病毒感染携带有EGFP和KOSM基因的Hep1-6细胞,12h后弃去病毒感染液,更换为含有10%胎牛的DMEM培养基。将感染后的Hep1-6细胞消化后计数,传代于饲养层细胞(feeder)上,更换为新鲜小鼠ES细胞培养基,之后每天更换培养基直到第10天克隆足够大时挑克隆扩大培养。4重编程后获得细胞的生物学特性1)重编程后细胞克隆形态及EGFP表达情况；2)AP染色；3) RT-PCR检测鼠ES细胞标志性基因表达；4)细胞免疫荧光检测鼠ES细胞标志性抗原表达；5)核型分析；6)悬浮培养观察拟胚体形成及体外分化情况；7)重编程后细胞接种至裸鼠皮下,观察成瘤情况。结果：1慢病毒载体pLentG-KOSM鉴定酶切鉴定pLentG-KOSM经Not Ⅰ和XBa Ⅰ线性化,酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳均可见预期大小的条带。PCR鉴定以质粒pLentG-KOSM为模板,分别扩增Oct4、K1f4、c-Myc和Sox2基因,PCR产物大小均与预期值相符。2慢病毒包装携带pLentG-KOSM的慢病毒载体与病毒包装质粒共转染293T细胞,24h后倒置荧光显微镜下可见绿色荧光,预示转染成功。按照上述方法进行慢病毒滴度测定,病毒滴度值都在1×106IU/ml以上。3慢病毒载体法重编程Hepl-6细胞病毒感染Hepl-6细胞后48小时可见绿色荧光,预示感染Hepl-6细胞成功,铺于饲养层细胞(Feeder)后第4天可见到iPS细胞样克隆出现,第10天克隆足够大可以挑克隆以扩大培养,预示着Hepl-6细胞已开始重编程。4.重编程后的细胞生物学特性鉴定1)第2-3天可见Hepl-6细胞形态发生变化,4-6天可见iPS细胞样克隆,10天左右见到典型iPS细胞样克隆,挑取典型克隆继续培养；多次纯化后得到三株典型iPS细胞样克隆形态的细胞；2)3株细胞均具有典型的iPS细胞样克隆形态,AP染色呈阳性；3)3株细胞未如预期表达ES细胞特有的标志性基因Nanog,Esgl,Daxl,Zfp296等；4)3株细胞能表达mES细胞特有的标志性抗原：Oct4(+),Sox2(+),Nanog(+)；5)3株细胞核型分析结果尚未回报；6)3株细胞均具有体外分化形成囊性拟胚体的能力；7)3株细胞迄今未能形成畸胎瘤,但是恶性程度较重编程前的Hepl-6细胞明显降低。结论：1.运用0ct4、K1f4、c-Myc和Sox2四种基因成功将Hepl-6细胞重编程。2.3株细胞的克隆均具有典型iPS细胞样克隆形态,并具备小鼠ES细胞或iPS细胞的一些生物学特性,且在体外长期传代中能够维持此特性,但体内实验迄今未见形成畸胎瘤。3.重编程后细胞恶性程度较重编程前Hepl-6细胞明显降低。