第一部分储存红细胞对树突状细胞在体迁移模式及功能的影响　　目的：　　通过研究小鼠来源的储存红细胞与小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞（immature dendritic cell, imDC）相互作用，探讨储存红细胞对imDC炎症应答、成熟度、在体迁移模式及功能的影响，为储存红细胞在体免疫清除机制提供数据参考。　　方法：　　（1）心脏采血制备C57BL/6J小鼠红细胞，储存至14天后为文中所用的“储存红细胞”(stored RBC）；（2）细胞因子联合培养法诱导C57BL/6J小鼠骨髓来源的造血干细胞分化为未成熟树突状细胞（imDCs）；（3）在低剂量LPS刺激基础上，imDC分别与新鲜红细胞组（LPS+fresh RBC组）、储存红细胞组（LPS+stored RBC组）和对照组（LPS+control组）体外共孵育10小时以备后续研究；（4）收集（3）中各组上清，酶联免疫吸附（ELISA）实验检测细胞因子及趋化因子分泌情况；（5）收集（3）中各处理组DC，裂解未被DC吞噬的红细胞，PBS洗涤去除红细胞碎片，流式细胞术检测DC表面标志物表达量；（6）收集（3）中各处理组DC经脚垫和尾静脉两种途径过继性回输至小鼠体内，BLI检测其在体迁移、归巢模式；（7）收集（3）中各处理组DC，通过混合淋巴细胞反应（MLR）检测抗原特异性T细胞增殖、活化及INFγ分泌；（8）将OVA275-264八肽同时加入至imDC与红细胞的共孵育体系，收集DC经脚垫免疫C57BL/6J小鼠，2周后二次免疫，分离小鼠腘窝淋巴结和腹股沟淋巴结，四聚体法检测体内OVA抗原特异性CD8+T细胞激活。　　结果：　　（1）红细胞储存14d后溶血率为（0.78±0.07）％，符合AABB、欧洲标准及我国相关标准（<0.8%）；红细胞白细胞去除率>99%，符合我国相关标准；（2）DC形态学观察：在骨髓诱导的第一天，DC小且圆，细胞膜光滑。第3天时可见多数为贴壁细胞，有少量小的半悬浮集落。第5天时可见细胞集落增大、增多，多数悬浮生长，细胞体积增大，表面有毛刺状突起，培养6天后，DC纯度（CD11c阳性细胞率）达65%以上；（3）储存RBC处理后，DC表面抗原CD40、CD80和CD86的表达率较新鲜红细胞组明显提高，分别为（89.31±5.46 vs.74.41±5.22）%、（70.56±5.18 vs.53.12±5.96）%、（71.54±5.47 vs.57.61±4.52）%，差异有统计学意义（P<0.01）。储存红细胞刺激DC表面趋化因子受体CCR1、CCR2、CXCR4和CCR5等表达率均较新鲜红细胞组明显降低，分别为（7.15±3.04 vs.35.42±3.54）%、（11.15±4.58 vs.30.85±4.18）%、（9.10±3.07 vs.20.41±3.15）%、（6.13±2.35 vs.15.47±3.58）%，差异有统计学意义（P<0.05）；储存红细胞组DC趋化因子受体CCR7表达率较新鲜红细胞组明显上调，分别为（38.58±4.75 vs.6.39±2.53）%，差异有统计学意义（P<0.05）；（4）储存红细胞组DC所分泌的促炎因子均显著高于新鲜红细胞处理组：IL-6（12340.5±453.2 pg/mL vs.6531.3±257.3 pg/mL）、TNF-α（8300.5±267.7 pg/mL vs.5201.6±167.7 pg/mL）、IL-12p70（247.9±20.5 pg/mL vs.198.9±16.4 pg/mL）、IL-1β（172.8±6.4 pg/mL vs.122.2±4.5 pg/mL）及趋化因子MCP-1（7905.8±282.3 pg/mL vs.5727±204.9 pg/mL）。而储存红细胞组抑炎因子IL-10的分泌则受到显著抑制（530.3±42.5 pg/mL vs.910.3±65.1 pg/mL)；（5）储存红细胞组DC经脚垫途径回输48h后，迁移到腘窝淋巴结（PLN）和腹股沟淋巴结（ILN）的比例(0.08±0.01)%和（0.02±0.005）%高于新鲜红细胞组（0.04±0.01）%和（0.003±0.001）%，两组之间有统计学差异（P<0.05）；储存红细胞组DC经静脉途径输注48h后，主要分布于脾脏、肝脏引流淋巴结，而新鲜组DC在肺脏、肝脏等实质器官分布较多，在脾脏和淋巴结等淋巴组织分布则较少，两组之间有统计学差异（P<0.05）；（6）imDCs激活 OVA257-264抗原特异性CD8+T细胞反应：①储存红细胞处理组imDCs递呈OVA抗原肽能力显著低于新鲜组（48.26%±3.54%vs.85.24%±5.85%, P<0.05）；②储存红细胞组imDCs刺激CD8+T淋巴细胞增殖能力亦弱于新鲜组（2.2±0.2×106 vs.3.2±0.2×106, P<0.05）；③imDCs刺激后，储存红细胞组IFNγ+CD8+T细胞比例低于新鲜组（0.32±0.05%vs.1.16±0.18%, P<0.05）；储存红细胞组孵育上清中IFNγ浓度亦低于新鲜组（7048.67±623.54 pg/mL vs.10599.23±1556.36 pg/mL, P<0.05）；④储存红细胞组DC刺激CD8+T细胞表达CD152平均荧光强度为（6.56±0.84），显著低于新鲜红细胞组（9.42±1.03）, P<0.05；⑤四聚体法检测不同处理组DCs免疫小鼠体内OVA特异性CD8+T细胞比例，储存红细胞组DC所激活抗原特异性CD8+T细胞比例显著低于新鲜组（0.647±0.14%vs.1.20±0.25%, P<0.05）。　　结论：　　与新鲜红细胞相比，储存红细胞诱导imDCs在表型、炎症性因子分泌及趋化因子受体表达谱等方面均具有明显差异，具体表现为：表面共刺激分子CD40、CD80、CD86表达上调、Th1类细胞因子分泌增加、趋化因子受体CCR1、CCR2、CXCR4、CCR5表达降低而CCR7表达上升，提示储存红细胞可促进imDC体外成熟和提高其迁移能力。进一步对DC抗原递呈能力和T细胞激活能力检测发现，储存红细胞处理imDCs后其OVA抗原肽递呈能力降低，且其诱导CD8+T细胞增殖、IFNγ分泌及成熟标志物CD152表达等方面显著低于新鲜红细胞组。以上结果表明，储存红细胞虽可促进imDC成熟且提高其归巢能力，但显著降低其抗原递呈能力和抗原特异性CTL激活能力。　　第二部分储存红细胞调控imDCs炎症应答及迁移归巢机制研究　　目的：　　研究imDC如何选择性识别储存红细胞，以及储存红细胞调控imDC炎症应答及迁移归巢的作用机制。　　方法：　　（1）实验分组：在低剂量LPS刺激的基础上，imDCs分别与新鲜红细胞（LPS+fresh RBC组）、储存红细胞组（LPS+stored RBC组）和对照组（LPS+control组）体外共孵育10小时,收取上清及imDC待后续分析。（2）流式细胞术检测储存RBC表面CD47含量改变，并通过透射电子显微镜和游离血红蛋白法检测imDCs对新鲜RBC和储存RBC的吞噬量。（3）流式细胞术检测DCs内活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）含量， ELISA方法检测ROS对DC分泌细胞因子的影响。（4）免疫荧光检测imDCs内微丝及微管的变化。（5）Western-Blot方法检测DC内Rho/ROCK、PI3k/Akt以及NF-κB信号通路的蛋白表达变化，进一步分别给予三种信号通路抑制剂后检测各蛋白表达变化及细胞内微丝及微管的重构。　　结果：　　（1）红细胞储存14天后表面CD47平均荧光强度较0天时降低（123.34±7.71 vs.166.53±10.41），DCs吞噬储存红细胞数量显著高于新鲜红细胞（7.91±0.89 vs.3.72±0.39, P<0.05）。（2）储存红细胞组DCs产生的活性氧高于新鲜红细胞组（568.12±17.62 vs.456.32±18.24），差异有统计学意义（P<0.05）；加入活性氧抑制剂后，DCs分泌各细胞因子含量减少。（3）储存红细胞可促进DCs内微丝或微管重排。（4）储存红细胞组DCs上调表达磷酸化的RhoA、ROCK、Akt以及NF-κB蛋白，加入各信号通路抑制剂后，各蛋白磷酸化水平受到显著抑制，同时胞内微丝、微管重排受抑制。　　结论：　　相比新鲜红细胞，储存红细胞表面下调的膜糖蛋白CD47通过与imDCs表面信号调节蛋白SIRPα相互作用，增强了DCs对其的吞噬能力，诱导imDCs分泌活性氧及炎症应答水平提升，从而促进了imDCs成熟；同时储存红细胞通过Rho/ROCK、PI3K/Akt以及NF-κB信号通路促进DCs细胞骨架的重排，提高DCs运动能力，促进其在体内向淋巴组织的迁移和归巢。