生物传感器是指能够对细胞所处环境中某一种或多种化合物(信号输入)的存在作出反应,并产生某种信号输出(如荧光)的基因通路。以植物为例,其叶片细胞的基因正常表达时,将不断合成叶绿素,保证植物能够进行光合作用和正常生长。假设某一化合物X能够阻遏叶绿素基因的表达,当环境中存在该物质时,作用于植物细胞中叶绿素基因的转录调控系统,叶绿素合成将被关闭,消耗的叶绿素得不到补充,于是叶片颜色趋于黄白。这里,植物细胞在某种程度上就可以看作是一种生物传感器。根据数字电路的原理,生物传感器的信号输入和输出应该只存在两个值:0(弱信号)或1(强信号)。生物传感器的数字电路是按照逻辑门原理逐层相连的。在合成生物学中,人们通过利用转录或翻译机制来实现基因的逻辑运算功能,利用基因功能的激活和关闭表示信号的强和弱,从而连通基因元件,并构成基因电路。本课题初步探索并描述了如何为构建基因逻辑门而合成受激活调控的启动子,从而为设计并构造复杂的生物传感装置探索方式方法。在基因逻辑门中,与门(逻辑乘法)具有一定的构建难度。取两个信号输入(i1和i2),当且仅当i1和i2的值同为1时,与门的输出值为1;否则输出值为0.在本课题的设计背景下,信号输入为一种或几种化合物(抗生素、激素等),信号输出为荧光。对于生物系统来说,与门应当在两个信号输入达到一定浓度时才输出强信号1(例如高水平荧光信号)。然而,如果计划利用该系统来检测污染物的存在,那么即使较低浓度的污染物的信号输入也应被视为1,因为多数对环境和人体有害的物质能够在较低浓度时表现出较大的急性毒性或长期毒性。例如,在食品安全风险评估中,评估的结果常以每日容许摄入量表示,指人或动物每日摄入某种化学物质(食品添加剂、农药和兽药等),对健康无任何已知不良效应的剂量,其单位通常为mg/kg体重或μg/kg体重,对应被评估物质尤其是污染物的浓度十分低。因此,生物传感器的构建应考虑到实际应用的前提和环境,应赋予其探测较弱信号输入的能力,即较高的反应敏感性。通常情况下,与门的构建是以基因转录激活系统为基础的,需要使用两种操纵基因来激活调控单一启动子。值得注意的是,与门需要较弱的启动子来保证只有当两个信号输入都存在时才产生信号输出。如果启动子过强,那么容易在只有一个信号输入激活基因转录表达,产生信号输出,从而失去了与门的逻辑功能。因此在本课题中,通过人工缩短DNA序列,修改了酵母基因组原有的弱启动子CYC1,大幅度削弱了其强度,用以构造所需要的受激活调控的合成启动子。同时,由于Ara C和Tet R’只能在细菌细胞中进行表达,因此需要通过将Ara C和Tet R’固有的DNA结合结构域分别与来自病毒的转录激活结构域VP64相连接,来设计能够在酵母细胞中正常表达的新型融合蛋白。VP64是VP16的四聚衍生物,国际上已有将VP64与其他DNA结合结构域进行融合并在酵母细胞中成功表达的先例。本课题中采用核定位序列NLS和表位标签HAtag序列来连接两种结构域,NLS的作用是帮助蛋白进入细胞核,而加入HAtag是为了能够用Westren Blot检测蛋白的表达。然而,在本课题中,两种融合蛋白的构建实验未能得到预期的结果,因此引入了基于Lex A的融合蛋白,以保证后续研究工作的进行。本课题中组建并且测试了一系列分别由不同数量的ara操纵基因、tet操纵基因和lex操纵基因排列构成的基因盒子,以分析操纵基因的数量对于启动子激活强度的影响,从而选择合适的基因盒子来进行调控。为了构建受两种信号输入(四环素和β-雌二醇)调控的与门,研究中还尝试了按一定的顺序将两种不同的操纵基因(tet操纵基因和lex操纵基因)排列组合,以较全面地测试操纵基因数目和排列顺序的不同对转录调控产生的影响,为与门的构建结构提供更为丰富的选择。研究中使用酵母增强绿色荧光蛋白作为信号输出,使用流式细胞仪检测技术测量荧光强度,以量化描述合成启动子的强度。由于融合蛋白和受激活启动子的构建工作都涉及基因线路中基本元件(DNA序列)的组装,因此需要选择快速有效的DNA组装方法。在本课题中使用了两种不同的DNA组装方法:Gibson法和MoClo法。这两种方法都采用一步反应技术,也就是说能够在一次实验中同时组装多个DNA片段。Gibson法需要提前配置酶反应体系,参照载体质粒的酶切端口序列设计恰当的引物,利用PCR扩增目的基因片段的同时,在其两端扩展与载体质粒端口互补的识别序列。其准备工作较为简单,利用该法插入单一片段较为方便,但同时按顺序连接多个基因片段的能力不如MoClo法。MoClo法是基于Golden Gate组装的一种基因整合策略,该法通过交替利用两种限制性内切酶的酶切位点,将复杂基因组装工作分成了三个水平。即利用Bpi I酶切插入单一基因片段的0级反应,利用Bsa I再次酶切将包含0级组件的各个质粒按序连接并插入下一级载体的1级反应,以及最后再次利用Bpi I酶切将包含1级组件的各个质粒按序连接并插入最终载体的2级反应。最终得到的质粒分子将包含完整的目的转录单元。本课题偏重于以MoClo法为主要技术基础,在其原理指导下,分级逐步改造了pRSII质粒系统(广泛应用于酿酒酵母细胞)。建立了包含0级、1级和2级在内的多个空载体,并将所需目的基因片段逐层插入和整合,使其能够执行受激活启动子、融合蛋白、完整转录单元乃至小型基因线路(与门)的复杂组装。随后将得到的合成质粒整合进入酵母基因组DNA,利用酿酒酵母细胞进行基因表达。在课题后期,使用β-雌二醇浓度梯度对酵母细胞进行了诱导,经过反复实验,得出了较为理想的受激活启动子所调控的荧光基因表达强度关于β-雌二醇浓度的变化趋势。低于3.1n M/L时,荧光强度随β-雌二醇浓度升高而显著增加;而高于3.1n M/L时,β-雌二醇表现出了明显的细胞毒性,导致酵母细胞正常生长繁殖受抑制,基因表达异常,故其荧光强度趋近于阴性对照菌株。融合蛋白构建的失败,可能是由于转录激活结构域VP64与固有DNA结合结构域的连接方式不当,影响了蛋白质的正常折叠。故而在实验室未来的工作中,如何将原本只能在细菌中工作的AraC和Tet R’与VP64或其他可用的转录激活结构域恰当的连接,保证其正确的折叠并行使原有的功能,将成为主要研究目标之一。在本课题研究中所构建的各类质粒,包括基因模块和载体,初步建立了实验室中MoClo法的应用系统,为未来的研究工作提供了方便。同时,受激活启动子的研究结果和融合蛋白构建过程中遇到的各类实际问题,提供了大量的宝贵经验,为日后成功构建与门乃至最终研制生物传感器奠定了基础。