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本研究分为二部分:
第一部分:MAPKs信号通路在HHPV中的作用及三七总皂苷干预(离体肺动脉环灌流实验)
目的:研究MAPKs信号通路在低氧高二氧化碳性肺动脉收缩(HHPV)中的作用;探讨三七总皂苷防治HHPV的机制及与MAPKs信号通路的关系。
方法:制备离体SD大鼠肺主动脉环、二级肺动脉环。分别观察肺主动脉环、二级肺动脉环在常氧及急性低氧高二氧化碳介质中(PO2=30-35mmHg,PCO2=55.60mmHg)的张力变化;在急性低氧高二氧化碳条件下分别用ERK1/2上游激酶抑制剂U0126、P38MAPK通路抑制剂SB203580以及三七总皂苷(PNS)孵育二级肺动脉,观察各自对低氧高二氧化碳性肺动脉收缩的影响;急性低氧高二氧化碳条件下用PNS+SB203580、PNS+U0126联合孵育二级肺动脉环,观察MAPKs通路抑制剂SB203580和U0126对PNS血管舒张作用的影响。
结果:①在常氧条件下,肺主动脉、二级肺动脉张力均无明显变化;②急性低氧高二氧化碳条件下二级肺动脉发生双向性收缩反应即:Ⅰ期快速收缩峰、Ⅰ期舒张、Ⅱ期持续收缩(和常氧组相比P<0.05):肺主动脉只在低氧高二氧化碳早期出现较明显的收缩峰,后期则变化不明显(和常氧组相比P>0.05);③低氧高二氧化碳条件下,二级肺动脉分别用U0126、SB203580孵育后,Ⅱ期持续收缩幅度明显下降(P<0.05),Ⅰ期快速收缩峰、Ⅰ期舒张均没有明显变化(P>0.05);④低氧高二氧化碳条件下,PNS可明显减轻HHPV的Ⅰ期快速收缩峰和Ⅱ期持续收缩幅度(和单纯低氧高二氧化碳组相比P<0.05)。用PNS+SB203580、PNS+U0126联合孵育二级肺动脉环,发现MAPKs通路抑制剂SB203580和U0126能增强低氧高二氧化碳条件下PNS的血管舒张作用(P<0.05或P<0.01)。
结论:
1.在离体条件下,急性低氧高二氧化碳(PO2=30-35mmHg,PCO2=55-60mmHg)可使肺主动脉出现早期快速收缩,并可使二级肺动脉环发生双向性收缩反应;
2.急性低氧高二氧化碳条件下,U0126、SB203580均能减弱二级肺动脉环的Ⅱ期持续收缩反应。这提示MAPKs信号通路参与了二级肺动脉双向性收缩反应的Ⅱ期收缩。
3.PNS可减轻低氧高二氧化碳性肺血管收缩:U0126、SB203580增强PNS引起的血管舒张。说明PNS和MAPKs信号通路抑制剂在减轻HHPV时具有协同作用;抑制P38MAPK、ERK1/2通路能增强PNS的血管舒张作用。
第二部分:MAPKs信号通路在HHPH中的作用及三七总皂苷干预(大鼠低氧高二氧化碳性肺动脉高压实验)
目的:研究MAPKs信号通路在大鼠低氧高二氧化碳性肺动脉高压(HHPH)发生发展中的作用:探讨三七总皂苷防治HHPH的机制及与MAPKs信号通路的关系。
方法:①慢性低氧高二氧化碳性肺动脉高压大鼠模型复制:雄性SD大鼠72只(体重200~220g),随机分成6组(n=12),即正常组(N),低氧高二氧化碳3天组(H3d)、1周组(H1w)、2周组(H2w)、4周组(H4w)和血塞通治疗组(Hp)。将后五组大鼠放入常压低氧高二氧化碳舱内,舱内氧气浓度维持在9%~11%,二氧化碳浓度维持在5%~6%(舱内水蒸汽用无水CaCl2吸收,多余二氧化碳用氢氧化钠吸收),每天8小时,每周6天。Hp组于每日进舱前半小时腹腔注射血塞通注射液(50mg·kg-1·d-1),其余各组大鼠腹腔注射等量生理盐水。N组置于舱外,自由呼吸空气,其他组饲养条件相同。在低氧高二氧化碳3天、1周、2周、4周(PNS组4周)及正常组用右心导管法测量平均肺动脉压(mPAP),颈总动脉插管测量平均颈动脉压(mCAP),分别称取右心室游离壁(RV)和左心室加室间隔(LV+S)重量;HE染色测量肺细小动脉管壁面积/管总面积[(WA/TA)%]。以mPAP、mCAP、RV/(LV+S)%、(WA/TA)%作为判断模型建立成功的指标。②western印迹法、免疫组织化学技术检测肺组织及肺血管p-P38、p-ERK、P38、ERK蛋白的表达。
结果:①H1w组mPAP为(35.26±2.04)mmHg,与N组比较差异有统计学意义(P<0.05):H2w组大鼠mPAP、RV/(LV+S)%及(WA/TA)%分别为(16.85±0.88)mmHg、(30.19±0.95)%和(44.10±2.29)%,与N组(11.00±0.62)mmHg、(23.41±0.97)%和(28.71±2.56)%]比较差异均有统计学意义(P均<0.05):H4w组稳定于高水平;上述指标n3d组与N组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)说明低氧高二氧化碳性肺动脉高压大鼠模型复制成功。②肺组织p-ERK蛋白在N组表达不明显,在H3d组表达上升为0.313±0.042,与N组(0.018±0.003)比较差异有统计学意义(P<0.05),且在H1w、H2w、H4w组均高水平表达,较N组差异有统计学意义(P<0.05)。H4w组p-ERK蛋白(0.217±0.03)较H2w组(0.358±0.043)表达减低(P<0.05)。③肺组织p-P38蛋白在N组表达不明显,在H3d组表达上升为0.225±0.071,与N组(0.012±0.006)比较差异有统计学意义(P<0.05),且在H1w、H2w、H4w组均有高水平表达。④肺小动脉壁p-ERK蛋白在N组表达呈弱阳性或阴性,H3d组表达上升为0.133±0.018与N组(0.107±0.016)比较差异有统计学意义(P<0.05);在H1w、H2w、H4w组表达水平逐渐升高,较N组差异有统计学意义(P<0.05)。⑤肺小动脉壁p-P38蛋白在N组和H3d组表达呈阴性或弱阳性,在H1w组表达上升为0.124±0.025,与N组(0.099±0.015)比较差异有统计学意义(P<0.05),在H2w、H4w组有高水平表达,较N组差异有统计学意义(P<0.05)。⑥PNS组肺组织p-P38、p-ERK蛋白,肺小动脉壁p-P38、p-ERK蛋白表达较低氧高二氧化碳4周组均降低(P<0.05),下降比例分别为75.59%、53.02%、84.86%和87.33%。
结论:MAPKs信号通路介导了低氧高二氧化碳性肺动脉高压的形成。PNS可能通过抑制P38MAPKs、ERK1/2通路来减轻低氧高二氧化碳性肺动脉高压的形成。