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目的:本实验室在之前SD大鼠脊髓全横断中用蛋白组技术发现原肌球蛋白(TPM4)在脊髓全横断后差异表达。本研究进一步阐述TPM4在脊髓全横断大鼠脊髓损伤上端中的表达定位并探讨TPM4在神经可塑性中的作用。方法:首先,将32只成年雌性SD大鼠随机分为正常对照组和手术组,其中手术组又分为脊髓全横断(Spinal cord transection, SCT)术后3天,14天和28天三个组(每组实验动物8只,n=8)。用荧光定量PCR(Q-PCR)及Western Blot技术验证SD大鼠在正常和脊髓全横断后3天,14天及28天TPM4的基因及蛋白水平表达变化,再通过免疫荧光组织化学(IF)对TPM4进行定位。然后,以HIV慢病毒为载体构建TPM4过表达(TPM4ORF)及TPM4干扰(TPM4SH)慢病毒重组体进行TPM4体内功能研究。在这部分,我们用32只成年雌性SD大鼠,随机分为假手术组,TPM4对照(Control)组,SCT大鼠给予TPM4ORF组和TPM4SH干扰组(每组实验动物8只,n=8)。通过在SCT大鼠脊髓上端局部注射TPM4过表达或TPM4干扰,用BBB评分检测SCT大鼠术后0,7,14,21和28天后肢运动功能。免疫荧光组织化学检测各组横断脊髓TPM4的组织定位,Western Blot检测术后28天各组横断脊髓TPM4的蛋白表达水平以判断TPM4过表达及干扰重组体慢病毒是否有效。最后,通过TPM4基因过表达及干扰慢病毒转染体外培养的原代脊髓神经元,分别在慢病毒转染前,转染后2和4天观察脊髓神经元并采集图片。计数各组神经元数量、胞体面积、神经突起长度变化,观察TPM4对体外培养脊髓神经元的生长作用。结果:1.①Q-PCR结果显示:与正常组比较,TPM4mRNA在脊髓全横断术后3d组,14d组及28d组表达逐渐增加;在术后3d组与14d组比较,TPM4mRNA在14d组增加且有显著性差异(P=0.036<0.05):术后3d组与28d组比较,TPM4mRNA在28d组明显增加,有显著性差异(P=0.003<0.05):术后14d组与28d组比较,TPM4mRNA在28d组增加,没有显著性差异(P=0.326>0.05)。②Western Blot结果显示:与正常组比较,TPM4蛋白水平在脊髓全横断术后3d组,14d组及28d组表达逐渐增加;在术后3d组与14d组比较,TPM4蛋白水平在14d组增加且有显著性差异(P=0.006<0.05):术后14d组与28d组比较,TPM4蛋白水平在28d组增加,没有显著性差异(P=1>0.05)。③IF结果显示:TPM4在脊髓的神经元及胶质细胞均表达,但主要以脊髓神经元表达为主。2.①成功包装了TPM4ORF和TPM4SH慢病毒重组体,体内注射入全横断的脊髓损伤上端后BBB评分显示:在术后7d,14d和28d脊髓TPM4ORF组和TPM4SH组两组均较TPM4Control组的BBB评分呈逐渐高趋势,但TPM4ORF组与TPM4Control组比较,BBB评分在7d,14d和28d均无显著性差异;比较之,TPM4SH与TPM4Control比较术后7d无统计学意义;而在术后14d,TPM4SH组较TPM4Control组BBB评分更高,差异有统计学意义(P=0.007<0.05);进而在术后21d,TPM4SH组较TPM4Control组比BBB评分亦升高,差异有统计学意义(P=0.000<0.05);同样,在术后28d, TPM4SH组比TPM4Control组BBB评分更高,差异有统计学意义(P=0.000<0.05)。而TPM4SH14,21,28d, BBB评分显著增加。②Western Blot结果显示:TPM4ORF组与TPM4Control组相比,TPM4ORF组条带较深;PM4SH组与TPM4Control组相比,TPM4SH组条带变浅。③IF结果显示:TPM4慢病毒重组体在神经元表达明显。3.在慢病毒转染后第2d, TPM4SH组和TPM4ORF组与TPM4Control组相比,细胞数量、胞体面积和突起长度均无明显变化(P>0.05);在慢病毒转染后第4d, TPM4SH组与TPM4Control组相比,TPM4SH组轴突长度显著增加,差异有统计学意义(P=0.019<0.05),脊髓神经元胞体的面积和数目无统计学差异;慢病毒转染后第4d, TPM4ORF组与TPM4Control组相比, TPM4ORF组的细胞体的面积明显增大,细胞数目显著增加,差异均有统计学意义(P<0.05),两者神经元轴突长度无统计学差异(P>0.05)。结论:应用慢病毒技术对TPM4在全横断大鼠体内进行了功能研究,提示TPM4可能参与了脊髓损伤后的修复作用,TPM4SH促进脊髓全横断SD大鼠运动功能恢复,其机制可能与促进神经突起生长有关。故本实验研究为今后临床脊髓损伤的治疗提供了分子基础。