目的 根据我国宫颈癌患者的流行病学资料,以感染率最高的HPV16、18、31、52、58五个型别作为研究对象,研制五价L2融合蛋白,并评价其免疫效果。为研制适于我国宫颈癌HPV高危型别区域特点的经济、广谱的HPVL2预防性疫苗提供依据。方法 我们在前期工作中已完成HPV16、18、58的L2融合蛋白疫苗的实验室研究,故本文中首先以HPV31、52型为研究型别,构建二价HPVL2融合蛋白。根据Gene Bank上公布的HPV31、52型L2蛋白11-200位氨基酸序列,设计合成两个型别L2该区域对应的优化密码子基因融合序列,并将其克隆至原核表达载体中。利用原核表达系统表达HPV31-52L2融合蛋白,纯化目的蛋白后免疫小鼠,用血清抗体检测、HPV假病毒体外中和试验及动物体内中和实验评价融合蛋白疫苗的免疫效果。并将二价HPV31-52 L2融合蛋白与三价HPV18/16/58L2融合蛋白混合铝佐剂免疫小鼠,进行免疫效果评价。结果一、包装制备了六个不同型别(HPV16、18、31、45、52、58)体内及体外 HPV 假病毒,病毒滴度在 108TCID50/ml-109/TCID50/ml。二、设计合成了表达HPV31-52型L2N端11-200aa融合蛋白的原核密码子优化基因,并插入原核表达质粒中。重组质粒在IPTG诱导下能表达相应的目的蛋白,经western-blot鉴定正确后进行蛋白纯化,得到纯度在90%以上的融合蛋白。三、将纯化的HPV31-52 L2N端11-200aa融合蛋白混合铝佐剂免疫小鼠,ELISA结果显示,融合蛋白能诱发产生高滴度的总抗体,加佐剂组免疫效果强于蛋白组,对HPV31、52型L2的总抗体滴度分别为1:102400、1:51200和1:51200、1:12800;体外中和实验结果显示,加佐剂组诱发抗体对HPV31、52型假病毒的中和滴度为1:1280,明显强于不加佐剂组。从交叉保护抗体水平来看,佐剂组效果亦优于蛋白组,加佐剂组诱发产生针对HPV16、18、45、58型假病毒的交叉中和抗体滴度分别为1:160、1:80、1:1280、1:640,而单纯蛋白组为1:80、1:40、1:640、1:160;动物体内中和实验结果显示,用HPV假病毒攻击小鼠时,对照组小鼠能检测到荧光信号,实验组小鼠检测不到荧光信号,说明融合蛋白对保护小鼠免受HPV假病毒的攻击具有一定的保护作用。四、将HPV31-52 L2融合蛋白与HPV18/16/58 L2融合蛋白混合铝佐剂免疫小鼠,体外中和实验结果显示,对HPV31、52型假病毒的中和抗体滴度为1:1600,诱发产生针对HPV16、18、58型假病毒的中和抗体滴度为1:3200,对HPV45型假病毒的交叉中和抗体滴度为1:3200。较之单独二价HPV31-52L2融合蛋白诱发产生的中和抗体及交叉中和抗体滴度均明显增强,较之单独三价HPV18/16/58 L2融合蛋白诱发的交叉中和抗体滴度明显增强,而对同型别HPV16、18型假病毒的中和抗体水平没有增强,对HPV58型假病毒的中和抗体水平水平降低;动物体内中和实验结果显示,用HPV五种型别假病毒攻击小鼠时,对照组小鼠能检测到荧光信号,实验组小鼠均检测不到荧光信号,说明二价、三价HPVL2融合蛋白混合对保护小鼠免受HPV假病毒的攻击具有保护作用。结论一、HPV31-52 L2N端11-200aa融合蛋白在原核表达体系中呈高效表达,表达量约占全菌20%。融合蛋白加铝佐剂免疫小鼠后,血清中能检测到高滴度的总抗体及一定水平的中和抗体和交叉中和抗体,动物感染模型也说明了此融合蛋白对预防HPV的感染具有一定的保护效果。二、二价HPV31-52 L2融合蛋白与三价HPV18/16/58 L2融合蛋白混合免疫小鼠后,诱发产生的中和抗体及交叉中和抗体水平较单独免疫二价融合蛋白的水平都高,较单独免疫三价融合蛋白的交叉中和抗体水平增高,中和抗体未增强,以上研究为高危型广谱HPV L2蛋白疫苗研发提供了实验室依据。