【背景】严重创伤等引起的大段骨缺损的治疗一直是骨科临床上的难题。组织工程骨的迅速发展为大段骨缺损的治疗提供了一种可行的方案。然而,目前组织工程骨(TEB)并没有广泛应用于临床大段骨缺损的治疗,主要因为植入体内的组织工程骨缺乏血管和神经的支配,致使组织工程骨体内成骨效果不佳。课题组前期在动物实验研究中发现感觉神经束植入组织工程骨可以显著促进组织工程骨成骨。然而目前感觉神经促组织工程骨成骨的体外细胞学机制并不明确。【目的】1.探究感觉神经促进组织工程骨成骨的体外细胞学机制;2.探究共培养体系中背根神经节(DRG)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖分化的影响;3.探究共培养体系中DRG对BMSCs作用的内在机制。【方法】1.通过全骨髓冲洗贴壁培养法提取BMSCs,并从细胞形态、多向分化潜能、特异性CD分子三方面鉴定提取的BMSCs;2.Transwell共培养体系的构建。取新生SD大鼠背根神经节(DRG)与绿色荧光大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs构建Transwell共培养体系。实验组为DRG与BMSCs Transwell共培养(可表示为DRG+BMSCs组),DRG神经细胞位于Transwell小室内,BMSCs正常接种于6孔板内。对照组为BMSCs单独培养组(可表示为BMSCs组);3.通过CCK8方法检测BMSCs增殖情况;通过茜素红、油红O、阿利辛蓝染色评估BMSCs成骨、成脂、成软骨三向分化的能力;4.通过克隆形成实验(CFU)检测BMSCs自我更新能力并通过RT-PCR实验检测BMSCs干性基因的表达以明确BMSCs干性是否增强;5.通过免疫荧光染色和Western blot方法检测自噬相关蛋白LC3的表达并采用透射电镜观察自噬小体的形成和数量探究细胞自噬的变化;6.采用Western blot方法检测BMSCs中AMPK/mTOR和AKT/mTOR信号通路的激活情况以确定本实验中介导自噬的信号通路;7.采用AMPK抑制剂Compound C阻断AMPK/mTOR通路。通过Western blot、免疫荧光检测自噬相关蛋白LC3,通过透射电镜观察自噬小体的形成,比较加入Compound C前后共培养组自噬强度和干性基因表达的变化,以明确AMPK/mTOR信号通路对BMSCs自噬和干性基因表达的调节作用;8.采用神经激肽1受体(NKIR)抑制剂阿瑞匹坦阻断DRG产生的P物质(SP)对BMSCs的作用,通过Western blot检测共培养组自噬相关蛋白LC3的变化并通过RT-PCR检测其干性基因的变化,以明确共培养体系中DRG作用于BMSCs的细胞因子。【结果】1.BMSCs的鉴定。细胞形态学观察发现:P3代细胞形态为典型的纺锤形或梭形并含绿色荧光;茜素红染色、油红O染色、阿利辛蓝染色均为阳性;细胞表面低表达造血细胞表面的标志分子CD34(2.3±0.37%,n=5)、CD45(2.4±0.19%,n=5)以及髓系细胞标志CD11b/c(1.4±0.13%,n=5),高表达间充质干细胞的标志之一CD90(99.6±0.24%,n=5)。因此,所培养的细胞为骨髓间充质干细胞,并且细胞纯度较高。2.共培养体系中BMSCs增殖和分化实验结果。(1)CCK8实验结果显示:Transwell共培养实验第2、4、6、8、10天,共培养组BMSCs CCK8检测的吸光度值均高于对照组BMSCs(P值<0.05),即共培养组BMSCs增殖能力强于对照组BMSCs,其中共培养第8天时两组增殖能力差异最显著。CCK8实验说明DRG与BMSCs共培养可促进BMSCs增殖。(2)茜素红染色结果显示:成骨诱导14天后,共培养组BMSCs比对照组BMSCs所形成的钙结节面积更大而且颜色更深;油红O染色结果显示:成脂诱导24天后,共培养组BMSCs比对照组BMSCs组所形成的脂滴更加饱满,脂滴数量更多;阿利辛蓝染色结果显示:成软骨诱导20天后,共培养组BMSCs比对照组BMSCs所形成的软骨基质团更大更饱满。共培养组BMSCs成骨、成脂、成软骨能力均强于对照组BMSCs,即BMSCs三向分化潜能在与DRG共培养后得到维持或增强。3.CFU实验和干性基因RT-PCR结果。(1)CFU实验结果显示:共培养组BMSCs克隆形成率显著高于对照组BMSCs(P值<0.05),即共培养组BMSCs克隆形成能力强于对照组BMSCs。(2)RT-PCR结果显示:共培养组BMSCs Sox2、Nanog、Oct4三种干性因子基因表达较对照组BMSCs均上调(P值<0.05)。DRG与BMSCs共培养可以增强BMSCs的细胞干性。4.BMSCs自噬检测结果。(1)激光共聚焦显微镜观察免疫荧光染色结果可见共培养组BMSCs中细胞自噬相关蛋白LC3的荧光强度强于对照组BMSCs。Image J荧光强度半定量分析发现:共培养组BMSCs细胞自噬相关蛋白LC3荧光强度平均OD值大于对照组BMSCs(P值<0.05);(2)Western blot条带半定量分析显示,共培养组BMSCs其LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值大于对照组BMSCs(P值<0.05);(3)透射电镜观察发现:共培养组BMSCs细胞自噬小体的形成数量显著多于对照组BMSCs。共培养组BMSCs自噬强度大于对照组BMSCs。5.Western blot检测AMPK/mTOR通路和AKT/mTOR通路。Western blot结果显示:与对照组BMSCs相比,共培养组BMSCs中AMPK/mTOR信号通路中P-AMPK表达上调且P-mTOR表达下调,而AKT/mTOR信号通路中P-AKT表达没有变化。共培养过程中BMSCs自噬的增强伴随着AMPK/mTOR信号通路激活,而AKT/mTOR信号通路无明显变化。6.AMPK阻断实验。Compound C抑制AMPK的激活,阻断AMPK/mTOR信号通路的传导后,(1)Western blot结果显示:DRG+BMSCs+Compound C组自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ表达量以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均小于DRG+BMSCs组(P值<0.05),大于对照组(P值<0.05)。(2)RT-PCR结果显示:DRG+BMSCs+Compound C组Sox2、Nanog、Oct4三种干性基因的表达量小于DRG+BMSCs组(P值<0.05),大于对照组(P值<0.05)。(3)透射电镜观察发现DRG+BMSCs+Compound C组自噬小体形成数量明显少于DRG+BMSCs组,多于对照组。AMPK特异性抑制剂Compound C可以显著降低共培养组中BMSCs的自噬水平以及干性基因的表达,AMPK/mTOR信号通路的激活介导了共培养体系中BMSCs自噬水平的增强。同时,本实验中DRG+BMSCs+Compound C组干性基因表达水平显著低于DRG+BMSCs共培养组进一步证明了自噬增强介导了共培养组BMSCs细胞干性的增强。7.NK1R抑制实验。NK1R特异性抑制剂阿瑞匹坦加入共培养体系后,(1)Western blot结果显示:DRG+BMSCs+aprepitant组自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值较DRG+BMSCs组显著下降(P值<0.05),但仍高于对照组(P值<0.05)。(2)RT-PCR结果显示:DRG+BMSCs+aprepitant组干性基因的表达水平较DRG+BMSCs组显著下降(P值<0.05),但高于对照组(P值<0.05)。DRG来源的SP对于BMSCs自噬水平升高以及干性基因表达的上调具有重要作用。【结论】DRG和BMSCs组成的Transwell共培养体系中,DRG可通过激活AMPK/mTOR通路促进BMSCs自噬水平增强,进而维持或增强BMSCs的干性。在这一过程中,DRG产生的感觉神经肽SP起到重要作用。本研究对于揭示感觉神经促组织工程骨成骨体外细胞学机制具有重要意义。