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试验一本研究根据GenBank中I群禽腺病毒(FAV-Ⅰ)代表株AAU46933(CELO株)的Hexon基因序列设计一对通用引物,摸索了合适的扩增条件,建立了SYBR Green I荧光定量PCR方法,并对9株鸡包涵体肝炎毒株的病毒滴度进行了测定,并与OD260法、TCID50法、EID50法测定的结果进行比较。试验结果表明,本方法的检测下限为0.98×102拷贝/ul。以TCID50为标准测定方法,经统计与学分析发现,EID50法与TCID50之间无统计学差异(P=0.591);荧光定量PCR法与TCID50测得结果之间存在线性相关性(相关系数r=0.965,P<0.05);OD260法与TCID50测得的结果间无相关性(P>0.05)。以上结果说明,荧光定量PCR法测定结果能够间接反映病毒感染力,与传统方法相比,该方法操作简单、耗时短、成本低,具有较高的应用价值。 试验二利用Ⅰ群禽腺病毒12个血清型标准毒免疫新西兰大白兔,制备阳性血清。将疑似Ⅰ群禽腺病毒的临床样品经卵黄囊接种SPF鸡胚,成功分离得到41个毒株,并用Ⅰ群禽腺病毒12个血清型的兔抗鸡阳性血清,对这41株临床分离株进行了血清型鉴定。同时,采用PCR方法成功扩增31株临床分离株的Hexon全基因,分别克隆于pMD19-T载体,对其进行了核苷酸序列测定、氨基酸序列推导、同源性比较及遗传进化分析。利用抗体检测试剂盒对采集的血清样品进行检测。运用PCR方法对某鸡场的鸡胚进行Ⅰ群禽腺病毒的病原检测。结果表明,本研究制备的血清能与相应的毒株之间形成明显的白色沉淀线,证明本试验成功制得了12个血清型标准毒的阳性血清。分离到的41个临床分离株均属于Ⅰ群禽腺病毒,其宿主以肉仔鸡为主。该病在我国有时呈地方性流行,流行季节明显。31个Ⅰ群禽腺病毒Hexon全基因序列长度多在2738bp~2899bp,编码706~952个氨基酸,且同一个地区的分离株序列长度基本相同、同源性高。Hexon基因的遗传进化树显示,31个分离株的分为基因2、4、8和10型,其中以基因2型为主。血清学试验表明,我国流行毒株的血清型有2、4、5、10和12型,血清2型和5型是优势血清型。血清样品抗体平均值在种鸡开产后极速升高,且阳性率全部转为100%。鸡胚中,Ⅰ群禽腺病毒检出率为36.5%。 试验三本试验运用生物学软件,分析Ⅰ群禽腺病毒临床分离株的Hexon蛋白序列,找出含有免疫保护相关的基因序列,并以优势血清型毒株为模板构建了原核表达质粒pGEX-6P-1-BJ和真核表达质粒pEGFP-N1-BJ。原核表达质粒pGEX-6P-1-BJ经诱导表达,成功表达出67.6KD大小的融合蛋白,该蛋白的最佳诱导剂浓度为0.8 mmol/L,最佳诱导时间为6h,其主要以包涵体的形式存在。