目的探讨Rac1与神经前体细胞增殖分化的关系,对于揭示神经干/前体细胞增殖分化的分子机制,具有重要的理论意义;为有效利用神经前体细胞治疗神经性疾病或促进神经损伤后修复提供理论依据。方法本实验从三个方面来研究Rac1与神经前体细胞增殖分化的关系:(1)取新生SD大鼠大脑皮层,原代培养获得混合胶质细胞培养体系,在10%血清的培养基中培养6 d,细胞汇合后更换无血清培养基继续培养。实验中设计4个时间点,即无血清培养0 d、2 d、4 d、10 d,用倒置相差显微镜观察细胞增殖分化的变化,免疫荧光染色技术鉴定细胞种类以及Rac1蛋白在细胞内的表达,通过Western blot检测Rac1及相关蛋白的表达变化。Pull-down assay检测分析Rac1及相关蛋白活性变化。(2)在新生SD大鼠大脑皮层原代混合胶质细胞培养6 d时,采用体外划伤方式造成一个约1 mm的细胞损伤,更换无血清培养基培养。O-2A前体细胞迁移到损伤区域,对迁移到损伤区域的细胞进行A2B5、Rac1蛋白的免疫荧光染色,研究O-2A前体细胞中Rac1的表达。(3)取新生大鼠大脑皮层,混合胶质细胞培养7-9天,采用恒温震荡差速贴壁法分离纯化O-2A前体细胞,通过A2B5、GFAP免疫荧光染色法鉴定O-2A前体细胞及2型星形胶质细胞;同时利用Western blot和Pull-down assay检测O-2A前体细胞分化过程中Rac1、Cdc42及活性蛋白的表达变化。结果(1)建立了新生SD大鼠大脑皮层原代混合胶质细胞培养体系,此体系底层主要是由Ⅰ型星形胶质细胞组成的单层细胞,GFAP染色呈阳性;在单层细胞上面有一些小圆形强折光性神经前体细胞生长,β-Ⅲ-Tubulin染色呈阳性。更换无血清培养基培养0 d-4 d期间上层神经前体细胞大量增殖,无血清培养4 d后,神经前体细胞向神经元方向分化,β-Ⅲ-Tubulin、Rac1染色呈阳性。Western blot定量结果分析显示,无血清培养4 d时神经前体细胞的Rac1蛋白表达水平明显高于无血清培养0 d时的表达水平,随后神经前体细胞向神经元方向分化,无血清培养10 d后神经前体细胞Rac1表达水平明显低于无血清培养4 d时的表达水平。Pull-down沉降Rac1活性蛋白,结果分析显示无血清培养4 d、10 d时Rac1活性蛋白表达水平高于无血清培养0 d的表达水平,即Rac1活性蛋白在神经前体细胞增殖分化过程的表达呈现上升趋势。此外,Cdc42蛋白在神经前体细胞增殖过程中表达无变化,而分化过程中表达下降;Cdc42活性蛋白表达呈现上升趋势。(2)建立了体外新生SD大鼠大脑皮层混合胶质细胞损伤模型,细胞损伤后换无血清培养,O-2A前体细胞迁移到损伤区域,分化为2型星形胶质细胞并修复损伤区域。免疫荧光染色发现Rac1蛋白在O-2A前体细胞迁移分化过程中始终表达。(3)成功分离纯化出O-2A前体细胞,细胞呈椭圆形,有典型的双极突起,A2B5免疫荧光染色呈阳性;在有血清和无血清培养基中分别分化为2型星形胶质细胞和少突胶质细胞。分化过程中Rac1、Cdc42蛋白的表达下降,而Rac1、Cdc42活性蛋白表达上升。Western blot定量结果分析显示,未分化的O-2A前体细胞的Rac1蛋白表达水平明显高于分化成熟的2型星形胶质细胞和少突胶质细胞的表达水平,具有显著性差异(p<0.05)。Pull-down沉降Rac1活性蛋白,结果显示分化成熟的2型星形胶质细胞和少突胶质细胞的Rac1蛋白表达水平明显高于未分化的O-2A前体细胞的表达水平。另外,在O-2A前体细胞分化过程中Cdc42蛋白的表达下降,活性蛋白表达上升,与Rac1的变化一致。结论Rac1与神经前体细胞的增殖分化过程密切相关,在神经前体细胞增殖过程中Rac1蛋白表达上升,而分化过程中Rac1蛋白表达下降。Rac1活性蛋白表达促进了神经前体细胞的增殖以及分化。