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灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)和胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)是两种世界范围内常见的果蔬真菌,它们都可以侵染植物,导致宿主植物组织发生腐烂,造成不可逆的结构破坏。在当前人们对于灰葡萄孢菌、胶孢炭疽菌等果蔬真菌的抑制,主要是采用化学杀菌剂处理,食源性的真菌抑制剂却鲜有报道。研究发现在真菌细胞膜上的羊毛甾醇14α-去甲基化酶(Sterol 14α-demethylase,CYP51)在细胞膜的麦角甾醇生物合成过程中的起到了重要的催化作用。目前已使用的抑制剂是通过对CYP51蛋白进行抑制,从而干扰麦角甾醇合成,使真菌活性受到影响。本研究使用了基于受体的虚拟筛选技术,在人参皂苷化合物数据库中发现了能够同时抑制灰葡萄孢菌和胶孢炭疽菌CYP51蛋白的人参皂苷CK,又利用分子对接等计算生物学技术以及抑菌实验等进行了验证,对人参皂苷CK抑制CYP51蛋白的作用机制、抑菌能力和在保鲜中的实际应用进行了分析研究。本文的主要研究内容包括:(1)抗真菌CYP51蛋白抑制剂的虚拟筛选基于本实验室前期的工作基础,构建了灰葡萄孢菌和胶孢炭疽菌CYP51蛋白的稳定结构。同时,完成人参皂苷化合物3D结构数据库的建设优化。借助Auto Dock vina软件,以受试真菌CYP51蛋白作为受体,对人参皂苷化合物数据库进行虚拟筛选。对筛选结束后结合能量最高的前10位候选化合物进行实验验证,发现人参皂苷CK对受试菌种同时具有明显抑制效果,其IC50分别为27.63μg/m L、43.01μg/m L,远远低于其他几种化合物。而后通过HPLC实验,以麦角甾醇相对含量为指标,验证人参皂苷CK对CYP51蛋白的抑制能力,其IC50分别为12.357μg/m L和19.100μg/m L。(2)人参皂苷CK抑制CYP51的作用机制研究利用计算生物学中的分子对接、分子动力学模拟等方法,开展了人参皂苷CK与两种受试真菌CYP51蛋白作用机制的探究。根据分子对接结合能量排序以及复合体系结构观察,确认人参皂苷CK能够对接在CYP51的活性区域内,并形成较强的相互作用,对接的结合能分别为-14.248 kcal/mol和-13.304 kcal/mol。通过对蛋白配体复合体系的分子动力学模拟,发现人参皂苷CK与两个CYP51蛋白的复合体系分别于20 ns和25 ns后趋于平衡,说明复合物体系能够很好的结合。观察模拟结束后的复合体系结构,发现灰葡萄孢菌CYP51蛋白活性中心的氨基酸残基MET439,CYS458,ILE459,GLN462和胶孢炭疽菌CYP51蛋白活性中心的氨基酸残基MET497,PHE498均与人参皂苷CK形成强烈的氢键相互作用。蛋白配体的稳定结合可能是人参皂苷CK对真菌CYP51蛋白表现出较强抑制效果的重要原因。(3)人参皂苷CK对受试真菌活性抑制效果的研究最小抑菌浓度(MIC)实验显示人参皂苷CK对两受试菌种的MIC分别为32μg/m L和64μg/m L,能够抑制菌丝生长的IC50分别为27.63μg/m L和43.01μg/m L。观察受试菌种菌丝体形态,发现人参皂苷CK作用后菌丝出现褶皱并粗糙,浓度继续增大时,则会导致更加严重的菌丝损伤。受试菌种细胞内容物泄漏量、胞外p H值和可溶性还原糖含量的测定,说明人参皂苷CK处理造成了受试真菌的细胞膜损伤,通透性增大,细胞质大量流出。受试菌种微观结构的观察显示真菌内部出现细胞器消失现象,且细胞壁细胞膜的损伤十分严重,进而导致了真菌的衰败和死亡。(4)人参皂苷CK对樱桃番茄抑菌保鲜效果的研究人参皂苷CK被应用于感染灰葡萄孢菌的樱桃番茄的抑菌保鲜实验中。细胞毒性实验的结果表明,所使用的人参皂苷CK在实验设置的剂量下没有表现出对J774小鼠巨噬细胞的细胞毒性,与空白对照组相比甚至对细胞表现出一定的保护作用,我们认为这可能与人参皂苷CK自身存在的抗炎抗氧化有关。经人参皂苷CK处理后,樱桃番茄感染模型的感官指标如失重率、色度值、腐烂率、组织硬度等都表现出一定的波动。与感染模型的BC组相比,32μg/m L和64μg/m L人参皂苷CK组抑制了灰葡萄孢菌的生长,降低了樱桃番茄重量、色度和硬度的损失,维持了樱桃番茄的感官品质。丙二醛(MDA)含量检测的结果表明人参皂苷CK能够有效抑制灰葡萄孢菌,降低丙二醛的含量。以上结果表明,经过人参皂苷CK处理后的樱桃番茄其腐烂程度有所降低,其储藏期也被延长。因此人参皂苷CK有潜力成为一种食源性的真菌抑制剂,应用在果蔬采后储藏保鲜中。本研究以果蔬真菌CYP51蛋白为作用靶点,充分利用了基于受体的虚拟筛选技术,发现一种食源性的真菌抑制剂人参皂苷CK,并结合分子动力学模拟解释了其作用机制,在抑制果蔬真菌和樱桃番茄保鲜实验中探究其实际应用效果,以期为开发一种新型食源性真菌抑制剂提供理论研究基础。