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本文以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的四重营养缺陷型(亮氨酸、色氨酸、组氨酸、尿嘧啶)菌株CEN.PK2-1C为研究对象，综合运用代谢工程和生化工程的理论和方法，结合酿酒酵母的基因组规模代谢网络模型S. cerevisiae iND750，从构建丙酮酸库-蓄流、构建延胡索酸的积累途径-引流、将碳流由丙酮酸转向延胡索酸合成途径-开阀等3个方面调控碳流代谢，以实现延胡索酸的高效积累。主要结果如下：(1)研究了调控硫胺素合成途径对实现丙酮酸积累的影响。通过敲除调控酿酒酵母CEN.PK2-1C硫胺素合成途径的两个关键基因THI2和THI3，使碳流积聚在丙酮酸节点。其中突变株FMME-002ΔTHI2丙酮酸产量最高，为3.38±0.22g/L。在此基础上，研究了硫胺素添加对FMME-002ΔTHI2发酵生产丙酮酸的影响。当硫胺素浓度为0.04mol/L，发酵36h时丙酮酸产量最高(3.82±0.14g/L)。其原因在于THI2的敲除显著降低了丙酮酸脱羧酶的活性，而硫胺素的添加在一定程度上提高了酶的活性。在FMME-002THI2菌株中过量表达THI2基因而获得的互补菌株的生理特性与对照菌株相似，证明了FMME-002THI2的代谢改变是由于THI2的缺失所致。为了进一步提高丙酮酸产量，研究了氮源种类和C/N比对丙酮酸积累的影响。发现以尿素为氮源时，在最优C/N比条件下，FMME-002THI2在96h可积累8.21±0.30g/L丙酮酸，而副产物乙醇仅有2.21±0.24g/L。(2)研究了导入米根霉的延胡索酸合成途径对酿酒酵母积累延胡索酸的影响。单独表达酵母自身的基因MDH3SKL及源于米根霉的苹果酸脱氢酶的编码基因RoMDH均能积累一定浓度的延胡索酸，而RoMDH的表达更能促进延胡索酸的积累。FMME-001↑RoMDH的发酵产物经红外光谱、1HNMR谱及13C NMR谱检测证实该工程菌株可以积累延胡索酸。在FMME-001↑RoMDH中过量表达来源于米根霉的延胡索酸酶的编码基因RoFUM1，导致延胡索酸产量下降。通过对合成途径中三个关键酶的活性及转录分析发现，丙酮酸羧化酶活性较低成为限制延胡索酸高效积累的关键因素。进一步在FMME-001↑RoMDH表达源于酿酒酵母自身的丙酮酸羧化酶的编码基因PYC2，使得FMME-001↑PYC2+↑RoMDH可积累延胡索酸3.18±0.15g/L。(3)研究了酿酒酵母线粒体氧化途径积累延胡索酸的情况。在酿酒酵母基因组规模代谢网络模型S.cerevisiae iND750的基础上，利用流量平衡分析(FBA)解析了基因FUM1、ACR1、SDH1-4、OSM1在积累延胡索酸中的生理作用，确定以FUM1基因为敲除靶点，并构建了工程菌株CEN.PK2-1C FUM1。在分批发酵条件下，该菌株可积累0.61g/L(0.018mmol/mmol glucose)延胡索酸。在此基础上，添加5g/L柠檬酸能够使延胡索酸产量由0.61±0.02g/L增加到0.82±0.02g/L，较不添加柠檬酸时提高了34.6%。(4)研究在酿酒酵母中同时引入线粒体氧化途径和胞质还原途径对延胡索酸积累的影响。以能积累8.21±0.30g/L丙酮酸的突变菌株FMME003为出发菌株，敲除FUM1基因使之可以积累0.25±0.01g/L延胡索酸。在此基础上，通过同时过量表达RoMDH和RoFUM1基因，引入胞质还原途径，但几乎检测不到延胡索酸。进一步在培养基中添加5g/L苹果酸，使延胡索酸产量从低于0.01g/L增加到0.42±0.02g/L。这一结果预示延胡索酸大量积累的基础在于将碳代谢流从丙酮酸节点导向苹果酸。(5)考察了丙酮酸羧化酶在延胡索酸合成中的生理作用。分别表达酿酒酵母自身PYC2基因和源于米根霉RoPYC基因发现，RoPYC的过量表达能更有效地将碳代谢流从丙酮酸节点导向延胡索酸，实现延胡索酸的积累。在此基础上，向发酵培养基中添加32g/L生物素使突变株FMME-004-6延胡索酸的产量从2.48±0.11g/L增加到3.48±0.13g/L，提高了40.3%。将培养基中镁离子浓度由0.8g/L增加到1.2g/L，使延胡索酸产量由3.48±0.13g/L上升到3.92±0.15g/L，提高了12.6%；通过进一步调控碳氮比(将尿素浓度降低到0.1g/L)，则使延胡索酸产量增加到5.64±0.16g/L，提高了43.9%。