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目的:
引起自身免疫性疾病重症肌无力(MG)的主要免疫原是人突触后膜烟碱型乙酰胆碱受体(AChR)α1亚基。用来自不同物种的包含AChRα1亚基主要免疫结构域(MIR)的蛋白或肽段免疫一些品系的动物,可以建立实验性自身免疫性重症肌无力动物模型(EAMG),供研究重症肌无力的发病机制和寻找有效治疗方法使用。但现阶段使用的模型建立方法或材料来源缺乏,或成本高昂,成功率也相差较大。本研究用DNA免疫方法探索一种更简便、实用的EAMG模型建立方法。
方法:
将含人乙酰胆碱受体α亚基N端主要免疫区(AchRα205)的基因、含大鼠白介素-6(IL-6)cDNA序列的基因分别亚克隆人真核表达载体pcDNA3.1(+)构建pcDNA3.1(+)/AChRα205、pcDNA3.1(+)/IL-6两种重组质粒,转化DH5α菌,筛选阳性克隆,进行测序鉴定。pcDNA3.1(+)/AchR a205质粒存在两处碱基突变,采用定点突变技术纠正后获得了含正确基因序列的重组质粒。构建的pcDNA3.1(+)/IL-6质粒经测序鉴定无突变。用重组质粒pcDNA3.1(+)/AchRα205单独或与pcDNA3.1(+)/IL-6联合免疫雌性Lewis大鼠,对照组用pcDNA3.1(+)免疫。免疫后观察实验大鼠的临床症状,并对血清抗AChR抗体、肌电图、组织病理与超微结构、组织基因整合和RNA转录进行检测与评估。
结果:
实验组动物出现了临床肌无力症状;肌电图重复神经电刺激(RNS)呈衰减反应;血清AChR抗体滴度增高,最高77.82pmol/L;组织学检查有肌细胞横断面钝圆、肌间隙少量淋巴细胞浸润和肌细胞中心核,酶免疫组织化学检测少部分肌细胞膜受体着色稀少;超微结构发现有线粒体空泡样变、突触后膜皱褶变少、变浅、结构简单化等退行性改变;这些变化在pcDNA3.1(+)/AchRα205与pcDNA3.1(+)/IL-6双质粒共注射建模组更明显。
结论:
以人AChRα205基因为目的基因、大鼠IL-6基因为细胞因子佐剂、pcD-NA3.1(+)为表达载体重组的质粒pcDNA3.1(+)/AChRα205、pcDNA3.1(+)/IL-6免疫Lewis大鼠建立了EAMG动物模型。