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研究背景:类风湿性关节炎(RA)是一种常见的以关节组织慢性炎症病变为主要表现的全身性疾病。全世界的患病率为1%,成人发病率为0.3%,大陆约有400万患者。该病呈慢性、进行性、侵袭性,若不能得到及时诊断和有效治疗,两年内的致残率可高达50%,可见危害性之重。RA病变特征是持续性进行性的滑膜炎,通常累及对称的周围关节。滑膜炎能引起软骨破坏和骨侵蚀,继而引起关节畸形而作为该病的标志。RA病程可表现多种多样。基因和环境因素控制着炎性反应的进程、范围和类型。RA病因尚不明确,西药治疗也多以控制为主。白花丹为白花丹科植物白花月(Plumbago zeylanica L.)的全草或根。其味辛、苦、涩,性温,有毒;具有祛风除湿,行气活血,消肿解毒的功效。常用治跌打损伤,痈疮肿毒,肝脾肿大,风湿疼痛、骨质增生,胃腹胀痛及牛皮癣等症。临床运用白花丹鲜品外敷治疗类风湿性关节炎取得了良好的效果。白花丹用于治疗RA的民间疗法为:取鲜品外敷于病变部位,感觉有麻刺感时取下,只敷一次,所敷之处,皮肤为黄色,半天后,变为黑色,两周后,皮肤颜色恢复正常,且疼痛消失。研究目的:白花丹具有祛风除湿的功效、能够用于风湿疼痛、骨质增生,临床运用白花丹治疗类风湿性关节炎取得良好效果,本实验通过探究白花丹治疗类风湿性关节炎的有效成分,并用相关药理实验加以验证,为临床应用提供理论基础。后续将制成更方便有效的中成药,造福于人类。同时,由于目前RA机理尚不明确,在验证该药疗效的过程中,有助于对RA机理的进一步研究。研究方法:1、对药材进行外观、粉末显微鉴定,找出结构中显著特征。2、以临床运用中的肤色变化特征与炎症药理模型结果为双向判断指标,来初步筛选白花丹治疗类风湿性关节炎的有效部位。具体操作方法为:用95%乙醇提取白花丹鲜药,取部分乙醇液,依次用石油醚、氯仿、乙醚、正丁醇萃取,分取各溶剂层。以角叉菜胶致大鼠足肿胀的炎症药理模型进行有效部位筛选,以大鼠治疗前后足容积变化加上人手指外敷试验皮肤颜色变化同时来推测可能的有效部位。3、对有效部位中各成分进行分离,先通过硅胶柱层析手段进行粗分,再利用高效制备液相色谱精分,分离出主要化合物,通过相关谱图解析,结构鉴定。考察指标成分的相关药学研究,如含量测定方法的建立,不同干燥方法对白花丹素含量的影响以及指标成分的稳定性考察。4、不同给药途径的类风湿性关节炎模型研究,建立CIA大鼠类风湿性关节炎模型。根据临床外用的给药形式,设计药理给药剂型为凝胶剂。设立灌胃给药与外敷给药的形式,并与阳性药Ⅱ型胶原蛋白组比较,以大鼠足肿胀度、脚掌厚度以及大鼠踝关节病理切片特征来验证白花丹临床运用治疗类风湿性关节炎的疗效。结果:1、药材外观,茎、叶、花特征明显;粉末显微鉴定中,导管、淀粉粒、气孔、棕色快、纤维形状是白花丹药材主要显微结构特征。2、乙醇提取液的分部位萃取,各萃取物,用人手指外敷30min,发现石油醚萃取物外敷后,手指有变黑的现象,与鲜药外敷现象一致。以角叉菜胶致大鼠足肿胀炎症药理模型验证各萃取物,得出结论,石油醚萃取物可以使致炎后的大鼠足肿胀消肿,其具有抗炎作用。综合以上两个指标,初步证明,有效部位可能为石油醚部位。3、分取有效部位中各成分,经过硅胶柱层析、高效制备液相分离后,其主要成分占石油醚提取物的80%以上,经相关结构谱图分析,其为萘醌类化合物白花丹素。指标成分的相关药学研究:采用HPLC法建立白花丹中白花丹素含量测定的方法,经方法学论证,线性关系良好;样品精密度和稳定性良好,加样回收率为98.35%±0.88%,该方法成功用于白花丹药材含量的测定。不同干燥方法对白花丹素含量的影响,结果显示,白花丹药材在干燥过程中,白花丹素含量有所下降,其中,采用阴干的干燥方法干燥白花丹药材,白花丹素含量下降最明显,其次是晒干,冷冻干燥方式含量较高,45℃烘干方式含量保存最高。考察酸、碱、光、氧对白花丹素的破坏作用,用HPLC测定含量变化,得出酸、碱、氧均对白花丹素有破坏作用,光破坏作用不明显。4、不同给药途径的类风湿性关节炎模型研究。给药剂型的确定,根据药物性质、剂型稳定性与透皮速率,选择凝胶剂作为外敷给药剂型。大鼠脚掌厚度与关节周长的测量中发现,外敷组大鼠各指标与正常组最接近,其次为灌胃组,阳性药Ⅱ型胶原蛋白组差别稍大。大鼠踝关节病理切片显示,通过观察滑膜增生、表皮及皮层下炎性细胞浸润情况以及对软骨的损坏程度来判断关节炎严重程度同样得出以上结论,白花丹在白花丹素含量为0.314mg·Kg-1时的剂量治疗CIA模型大鼠效果比阳性药在剂量为60μg· Kg-1时治疗效果好,说明白花丹对CIA模型大鼠有治疗作用。结论:1、白花丹药材外观与粉末鉴定中的特征结构可以可为该药材鉴定依据。2、白花丹抗类风湿性关节炎的有效部位为石油醚部位,其主要成分为白花丹素。3、白花丹对Ⅱ型胶原诱导性关节炎具有显著疗效,能够明显减轻大鼠足肿胀率和关节受损程度,抑制滑膜细胞增生。证明白花丹能够治疗类风湿性关节炎。