家蚕翅发育相关基因的功能分析

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昆虫是地球上种群最多且唯一有翅的无脊椎动物。翅的产生不仅有利于昆虫觅食、躲避敌害、扩大分布范围,而且翅对于某些昆虫的求偶、交配等行为具有必不可少的重要作用。家蚕属于鳞翅目昆虫,同时又是重要的模式昆虫,但是对家蚕的翅发育机制的研究仍然存在一些未知的问题。本研究主要从两个方向对调控家蚕翅发育的基因进行了研究和功能验证。首先从正向遗传学的方向出发,利用STS分子定位技术,将家蚕雏翅突变的基因(mw)定位于第22号染色体上的275kb的范围内。通过比对在定位的275kb的区域内,一共存在15个候选基因。通过对这15个基因在mRNA水平的表达分析,基因Bmapp在翅原基中具有很高的表达,同时在突变体和野生型中存在明显的表达差异,因此推测Bmapp可能是导致雏翅表型的关键基因。之后利用CRISPR/Cas9系统,对家蚕早期胚胎直接注射体外合成的Cas9mRNA和针对Bmapp的特异的sgRNA混合物,从而获得了敲除Bmapp的突变体家蚕。在Bmapp突变体家蚕中,家蚕翅发育异常,与雏翅突变体相似,因此确定Bmapp是雏翅突变的关键基因。通过对雏翅突变体和野生型家蚕Bmapp基因顺式调控元件的比较发现,在突变体中Bmapp基因的启动子存在10bp的插入,且突变体中Bmapp启动子的活性明显低于野生型,与翅发育相关的Hippo信号通路活性也明显降低。这表明雏翅突变体中启动子区域10bp的插入严重影响了Bmapp启动子的活性,使得在突变体中Bmapp的表达量降低,最终影响Hippo信号通路基因的表达,导致了雏翅表型的产生。其次,从反向遗传学的方向出发,利用CRISPR/Cas9系统,在BmHh基因的一号外显子和三号外显子根据GGNN18NGG原则分别设计一个sgRNA靶点,构建Cas9表达载体和sgRNA表达载体,分别在家蚕早期胚胎中显微注射,获得两个独立的转基因家蚕品系。将两种转基因家蚕杂交后,从而获得BmHh敲除的突变体家蚕。BmHh的敲除导致家蚕翅和部分成虫盘发育异常。具体表型表现为:在突变体家蚕中,家蚕翅变小甚至消失,家蚕成虫触角成囊泡状,雌雄外生殖器畸形。通过qRT-PCR检测分析突变体家蚕和野生型的基因表达差异,显示在BmHh突变体中的多个和翅发育相关的信号通路的基因表达发生显著的下调。这表明家蚕Hedgehog信号通路调控家蚕翅的形成,可以作为鳞翅目害虫生物防治的靶标基因。
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