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目的:研究蕨麻正丁醇部位对体外培养心肌细胞缺氧损伤的保护作用及机制。
方法:(1)取新生1~3d的SD大鼠心肌细胞原代培养,采用MTT法检测不同缺氧时间细胞的存活率、生化手段检测培养基中乳酸脱氢酶(LDH)活性,以确定心肌细胞的最佳缺氧时间,建立心肌细胞缺氧损伤模型。(2)将搏动状态良好,生长密度无明显差异的心肌细胞随机分为正常对照组、缺氧损伤模型组、蕨麻正丁醇部位高、中、低剂量(0.003g/ml、0.0015g/ml、0.00075g/ml)组(缺氧同时加入蕨麻正丁醇部位)、阳性药物丹参(0.003g/ml)组。缺氧6h后,通过细胞存活率、细胞活力、凋亡细胞数、HE染色、PI-Hoechst染色、总蛋白含量测定及生化指标LDH、CK的检测观察不同剂量厥麻正丁醇部位对心肌细胞缺氧损伤的保护作用;通过检测生化指标SOD、MDA、NO、NOS;免疫细胞化学染色检测caspase3、caspase9蛋白含量;RT-PCR技术检测caspase3、caspase9基因表达水平,探讨其作用的可能机制。
结果:(1)心肌细胞形态学改变:倒置显微镜下,正常对照组心肌细胞从第三天起成簇生长,搏动明显,细胞簇数量增多,细胞形状多样化,呈圆形、梭形及锥形,并有枝芽状突起,向细胞簇周围呈放射状生长,折光性强。缺氧损伤后,胞体折光性下降,突起缩短或消失,搏动减弱或消失,蕨麻正丁醇部位高剂量组心肌细胞形态较模型组明显改善。(2)模型缺氧时间的确定:心肌细胞缺氧0~6h,细胞活性变化幅度最大,单位时间内细胞明显减少,LDH的外漏量显著增加(P<0.01),将缺氧时间延长至24h和48h,O.D值和LDH的外漏量无显著变化,曲线趋于平坦,确定本实验中心肌细胞缺氧模型的缺氧时间为6h。(3)心肌细胞存活率:模型组(57.7%±3.9%)明显低于正常组(94.1%±1.2%)(P<0.01);厥麻正丁醇部位高剂量组(82.3%±4.1%),厥麻正丁醇部位中剂量组(81.2%±3.8%),厥麻正丁醇部位低剂量组(79.9%±4.0%)均明显高于模型组(P<0.01)。(4)心肌细胞活力:模型组(0.053±0.003)明显低于正常组(0.315±0.012)(P<0.01):厥麻正丁醇部位高剂量组(0.157±0.011),厥麻正丁醇部位中剂量组(O.104±0.019),厥麻正丁醇部位低剂量组(0.039±0.011)均明显高于模型组(P<0.05或P<0.01)。(5)蕨麻正丁醇部位高剂量组可明显降低缺氧损伤细胞凋亡的数量。(6)与正常组比较,模型组细胞蛋白总量明显减少(P<0.01);厥麻正丁醇部位高剂量及中剂量组细胞损伤明显改善,总蛋白量较模型组显著增加(P<0.01)。(7)蕨麻正丁醇部位各剂量组均可显著降低缺氧损伤心肌细胞LDH、CK的外漏量(P<0.01);提高细胞内SOD活性(P<0.01);减少MDA的产生(P<0.05);升高NO含量(P<0.01)及NOS水平(P<0.05)。(8)厥麻正丁醇部位高剂量组可显著降低caspase3、caspase9蛋白的表达(P<0.01)。(9)RT-PCR:厥麻正丁醇部位高、中、低剂量组与模型组比较,均可显著降低缺氧心肌细胞caspase3,caspase9 mRAN表达水平(P<0.05或P<0.01)。结论:蕨麻正丁醇部位能够显著提高缺氧损伤心肌细胞的存活率,提高缺氧状态下心肌细胞活力,减少缺氧心肌细胞凋亡数量,减轻心肌细胞缺氧损伤程度。其机制可能涉及抗氧化作用、增加NO产生及减弱caspase级联反应,抑制心肌细胞凋亡。